Optimización de condiciones experimentales para la identificación de L. chagasi analizando diferentes secuencias del genoma

Abstract

La leishmaniasis visceral es una zoonosis grave causada por Leishmania donovani y Leishmania infantun/chagasi, para la cual los perros infectados son el principal reservorio. Con el objetivo de disponer de métodos específicos para la identificación del genoma de Leishmania chagasi en muestras de caninos se optimizaron las condiciones químicas y térmicas para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con la cual se amplificaron dos fragmentos diferentes de Leishmania chagasi. Las reacciones fueron PCR sencillas llevadas a cabo con un volumen final de 25ul y contuvieron 1X de Buffer de PCR, 0,2gM de cada oligonucleótido cebador (RV1/RV2 o LCS1/LCS3); 0,2mM de una mezcla equimolecular de dNTPs, 1U de Taq ADN polimerasa y 1,5 o 2,0mM MgCl2, según se utilicen los pares de primers RV1/RV2 dirigidos a una secuencia de ADN altamente repetitiva del ADN kinetoplastidico o LCS1/LCS3 dirigidos a genes de ARNr18S. En todos los casos se incorporaron controles positivos cedidos gentilmente por el Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben” y controles negativos consistentes en agua destilada. Las condiciones térmicas para la amplificación mediada por primers RV1/RV2 fueron: desnaturalización inicial: 94°C por 5min, luego 35 ciclos de desnaturalización a 94°C por 60seg; pegado de primer: 59°C por 60seg; extensión: 72°C por 60seg; extensión final: 72°C por 5min; incubación: 4°C hasta su utilización. Las condiciones térmicas para la amplificación mediada por primers LCS1/LCS3 fueron: desnaturalización inicial: 94°C por 2min, luego 40 ciclos de desnaturalización a 94°C por 30seg; pegado de primer: 55°C por 30seg; extensión: 72°C por 60seg; extensión final: 72°C por 2min; incubación: 4°C hasta su utilización Los productos de amplificación de ambas reacciones fueron fragmentos de 145pb y 259pb respectivamente. Éstos fueron separados y visualizados por electroforesis en gel de agarosa 2%, teñidos con bromuro de etidio y observados por transiluminación UV. Dada la elevada sensibilidad y especificidad de los métodos moleculares, cuando fueron aplicados a muestras de control positivos ambas dieron bandas de amplificación detectables del tamaño esperado, no observándose bandas en muestras de ADN control correspondientes a Leishmanias braziliensis.