Optimización de condiciones experimentales para la identificación de L. braziliensis analizando diferentes secuencias del genoma

Abstract

Las leishmaniasis cutánea y mucosa son enfermedades infecciosas causadas por diferentes especies de protozoos del género Leishmania, transmitidas a humanos y animales por vectores de la familia Psychodidae. En América, una de las especies involucradas corresponde al subgénero Viannia especie braziliensis. En el Servicio Veterinario de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Veterinarias (UNNE) se optimizaron las condiciones químicas y térmicas para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con la cual se amplificaron dos fragmentos diferentes del genoma de Leishmania braziliensis. Las reacciones fueron PCR sencillas llevadas a cabo con un volumen final de 25ul que contuvieron: 1X de Buffer de PCR, 0,2 pM de cada oligonucleótido cebador (b1/b2 o B1/B2); 0,2mM de una mezcla equimolecular de dNTPs, 1U de Taq ADN polimerasa y 1,5mM MgCU. En todos los casos se incorporaron controles positivos consistentes en ADN de L. braziliensis cedidos gentilmente por el Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben” y controles negativos consistentes en agua destilada. Las condiciones térmicas para la amplificación fueron: desnaturalización inicial: 95°C por 5min, luego 35 ciclos de desnaturalización a 95°C por 30seg; pegado de primer: 61°C por 60seg; extensión: 72°C por 60seg; extensión final: 72°C por 10min; incubación: 4°C hasta su utilización. Los productos de amplificación de ambas reacciones fueron fragmentos de 103pb y 750pb respectivamente. Éstos fueron separados y visualizados por electroforesis en gel de agarosa 2%, teñidos con bromuro de etidio y observados por transiluminación UV. Dada la elevada sensibilidad y especificidad de los métodos moleculares, cuando fueron aplicados a muestras de control positivos ambas dieron bandas de amplificación detectables del tamaño esperado no observándose bandas en muestras de ADN de L. chagasi.