Caracterización de una fracción con actividad proteolítica aislada del veneno de Bothrops alternatus mediante reparto líquido-líquido combinado con tamiz molecular

Abstract

Trabajos previos demostraron la aplicabilidad de los Sistemas Bifásicos Acuosos (SBA) formados por el polímero de cadena flexible PEG (polietilenglicol) y fosfato de potasio para la purificación de proteínas de secreciones ofídicas, con un rendimiento que quintuplica al método convencional (cromatografía líquida). Así se empleó con éxito el sistema PEG 3350-fosfato, para el aislamiento de una fracción enzimatica con actividad proteolítica (Metaloproteinasa, MP) del veneno de Bothrops alternatus a partir de la fase inferior del sistema, rica en fosfato. En este trabajo se caracterizó esta fracción proteica aislada por esta metodología alternativa, MPSBA, a los efectos de compararla con la MPBaltergina purificada por método cromatográfico convencional. Para su caracterización se llevó a cabo una electroforesis SDS-PAGE (en condiciones reductoras y no reductoras) para la estimación de la masa molecular de MPSBA. La actividad proteolítica se determinó sobre caseína mientras que el efecto de EDTA se evaluó sobre azocaseína preincubando la enzima aislada con este inhibidor (0 a 180 mM) durante 30 minutos a 37°. El efecto de cationes divalentes fue determinado también sobre azocaseína preincubando MPSBA con MgCl2, CaCl2, ZnCl2, y HgCl2 (concentración final 5 mM). Se constató la actividad hemorrágica de la fracción enzimática aislada a través de la observación de halos de hemorragia producidos al inyectar MPSBA por vía intradérmica en la región abdominal de ratones albinos de la cepa CF-1, removiéndose la piel luego de 2 hs. El efecto miotóxico in vitro se llevó a cabo sobre la línea celular de mioblastos murinos C2C12 (DMEM - 5% de SFB - 5% CO2, 37 ºC) con MPSBA (0 a 150 ug/ml) , midiéndose la viabilidad celular por colorimetría (cristal violeta). El SDS-PAGE mostró, en presencia y ausencia de β-mercaptoetanol, una banda del orden de 59 kDa evidenciando ser una proteína constituida por una única cadena polipeptídica. MPSBA exhibió actividad hemorrágica y proteolítica (18.02 U/mg), las que fueron inhibidas por la acción del EDTA, concentración dependiente, anulándose la actividad sobre azocaseína a niveles de 40 mM de EDTA. Estos resultados demuestran que MPSBA es una metaloproteinasa, tratándose de una enzima Zinc-dependiente, sensible a este quelante orgánico. La actividad proteolítica sobre azocaseína, medida en presencia de los cationes divalentes metálicos, mostró que Zn2+ y Hg2+ actuaron como inhibidores reduciendo en un 65 y 20% la actividad total, respectivamente, para la dosis ensayada. En cambio, la actividad se incrementó con Mg2+ en un 138% y sensiblemente con Ca2+, 180%. En cuanto al efecto miotóxico in vitro se observó una reducción de la viabilidad celular en función de la concentración de MPSBA. Se obtuvo así una fracción con actividad proteolítica y hemorrágica compatible por su tamaño y comportamiento con una metaloproteasa tipo PIII, semejante a MPBaltergina. Teniendo en cuenta que es una metodología sencilla con un rendimiento superior al método convencional, se concluye que el reparto a través de Sistemas Bifásicos Acuosos combinado con tamiz molecular, se muestra como una metodología apropiada para obtener esta fracción y ser así e.g. empleada en la preparación de sueros antiofídicos específicos, los cuales requieren cantidades considerables de antígenos.