Identificación fenotípica, por espectrometría de masas MALDI-TOF y secuenciación de hongos filamentosos que causan onicomicosis o dermatofitosis recolectados en un laboratorio clínico de la ciudad Medellín, Colombia

Abstract

La incidencia de las infecciones fúngicas se ha incrementado significativamente en las últimas décadas, actualmente estas representan un importante problema de salud para los humanos. Entre algunos de los factores que contribuyen a su aumento se pueden enunciar; los tratamientos inmunosupresores, las infecciones invasivas o diseminadas, los pacientes trasplantados de órganos, y la infección con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Las infecciones fúngicas pueden tener varias presentaciones, unas de las más comunes son las superficiales (piel y mucosas) seguidas de las invasivas o diseminadas como la candidemia o la aspergilosis, siendo estas últimas las más graves por el impacto en la morbilidad y mortalidad a pesar de la disponibilidad de antifúngicos con diferente espectro de actividad. La identificación correcta y oportuna de los agentes causales es importante desde el punto de vista epidemiológico y terapéutico. Los métodos fenotípicos usados para la identificación de los agentes causales de las micosis aún no son suficientes para realizar una identificación, además suelen tomar tiempo, ser laboriosas y requerir profesionales altamente entrenados. Las técnicas moleculares basadas en la detección de ácidos nucleicos, son actualmente el estándar de oro para la identificación de hongos, partir de muestras clínicas de cultivos. Sin embargo, estas técnicas son costosas para un laboratorio de diagnóstico micológico de rutina en países en vías de desarrollo. La espectrometría de masas (EM) MALDI-TOF es una técnica utilizada actualmente con éxito en la identificación de bacterias y levaduras, sin embargo, el uso con hongos filamentosos tiene limitaciones por aspectos, como la falta de cobertura de la bases de espectros de referencia para la identificación de algunos géneros y especies, 0 principalmente de hongos endémicos en regiones tropicales. Además, la extracción de proteínas es más laborioso y difícil si se compara con el de las levaduras. La creación de bases de espectros in house de hongos endémicos y de diferentes especies cripticas, amplía la posibilidad de identificar más microorganismos correctamente. En este trabajo se construyeron 21 espectros de referencia con hongos de los géneros: Microsporum, Trichophyton, Aspergillus, Fusarium, Sporothrix y Neoscytalidium. Siguiendo los criterios recomendados por la casa comercial (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania). Además, se estandarizaron los tiempos mínimos de crecimiento fúngico que permitieran una correcta identificación de las diferentes especies. Los espectros de referencia se validaron con cepas o aislados clínicos, previamente identificados por secuenciación. Finalmente se evaluó la capacidad de los espectros creados para identificar 52 aislados clínicos obtenidos de pacientes que acudieron a un laboratorio clínico de la ciudad de Medellín para la confirmación microbiológica de onicomicosis o dermatofitosis. Los aislados clínicos también fueron identificados por la librería comercial (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania). Los tiempos de crecimiento variaron entre las especies siendo el máximo tiempo (96 h) para Microsporum canis y complejo Trichophyton rubrum, el mínimo (36 h) para Sporothrix spp. La identificación hasta especie de los aislados clínicos con la biblioteca construida in house fue del 88,4 % mientras que con la comercial fue del 37,0 %. Uno de los resultado más relevantes fue la identificación de las especies del complejo Sporothrix schenckii (S. globosa y S. schenckii sensu stricto) y del complejo Sporothrix pallida (S. mexicana) a partir de la forma micelial de 36 h de crecimiento. Con las especies del grupo de los dermatofitos se presentaron dificultades tanto en la validación del espectro de referencia de Nannizzia gypsea como en la identificación de aislados de la especie T. interdigitale. 1 El análisis de la concordancia entre la identificación por secuenciación y la obtenida por ambas bibliotecas mostró que fue mayor con la biblioteca construida in house (κ= 0,826) que con la comercial (κ= 0,273). Los resultados de este trabajo muestran que EM MALDI-TOF, es una metodología que se debe considerar como alternativa al método fenotípico clásico para la identificación de hongos filamentosos en un laboratorio de diagnóstico micológico de rutina, por la reducción en el tiempo y el costo del procedimiento, que se ve reflejado en la disminución de la estancia hospitalaria, morbilidad y mortalidad.

The incidence of fungal infections has increased significantly in recent decades, these currently represent a major health problem for humans. Among some of the factors that contribute to its increase can be stated; immunosuppressive treatments, invasive or disseminated infections, organ transplant patients, and infections with the human immunodeficiency virus (HIV). Fungal infections may have several presentations, one of the most common being superficial (skin and mucous), followed by invasive or disseminated such as candidemia or aspergillosis, the latter being the most serious due to the impact on morbidity and mortality at despite the availability of antifungals with different spectrum of activity. The correct and timely identification of the causative agents is important from the epidemiological and therapeutic point of view. The phenotypic methods used for the identification of the causative agents of mycoses are not yet sufficient to perform an identification, in addition they usually take time, are laborious and require highly trained professionals. Molecular techniques based on the detection of nucleic acids are currently the gold standard for the identification of fungi, based on clinical samples of cultures. However, these techniques are expensive for a routine mycological diagnostic laboratory in developing countries. MALDI-TOF mass spectrometry (EM) is a technique currently used successfully in the identification of bacteria and yeasts, however, the use with filamentous fungi has limitations by aspects, such as the lack of coverage of the reference spectrum bases for the identification of some genera and species, mainly of endemic fungi in tropical 3 regions. In addition, protein extraction is more laborious and difficult compared to that of yeasts. The creation of in-house spectra bases of endemic fungi and of different cryptic species, broadens the possibility of identifying more microorganisms correctly. In this work, 21 reference spectra were constructed with fungi of the genera: Microsporum, Trichophyton, Aspergillus, Fusarium, Sporothrix and Neoscytalidium following the criteria recommended by the commercial house (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). In addition, the minimum fungal growth times that allowed a correct identification of the different species were standardized. The reference spectra were validated with clinical strains or isolates, previously identified by sequencing. Finally, the ability of the spectra created to identify 52 clinical isolates obtained from patients who went to a clinical laboratory in the city of Medellin for microbiological confirmation of onychomycosis or dermatophytosis was evaluated. The clinical isolates were also identified by the commercial library, (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). The growth times varied between the species being the maximum time (96 h) for Microsporum canis and Trichophyton rubrum complex the minimum for Sporothrix spp (36 h). The identification up to species of the clinical isolates with the library built in house was 88.4% while for the commercial one it was 37.0%. One of the most relevant results was the identification of the species of the Sporothrix schenckii complex (S. globosa and S. schenckii s.st) and of the Sporothrix pallida complex (S. mexicana) from the mycelial form of 36 h of growth. Difficulties were encountered with the species of the dermatophyte group both in the validation of the reference spectrum of Nannizzia gypseum and in the identification of isolates of the T. interdigitale species. 4 The analysis of the agreement between the identification by sequencing and that obtained by both libraries showed that it was greater with the library built in house (κ = 0.826) than with the library (κ = 0.273). The results of this work show that EM MALDI-TOF is a methodology that should be considered as an alternative to the classic phenotypic method for the identification of filamentous fungi in a routine mycological diagnostic laboratory, due to the reduction in time and cost of procedure, which is reflected in the decrease in hospital stay morbidity and mortality. The results of this work show that EM MALDI-TOF is a methodology that should be considered as an alternative to the classic phenotypic method for the identification of filamentous fungi in a routine mycological diagnostic laboratory, due to the reduction in time and cost of procedure, which is reflected in the decrease in hospital time, morbidity and mortality.