Genotipos de aislamientos de Cryptococcus de pacientes y muestras ambientales del Instituto Nacional Cardiopulmonar, utilizando PCR-RFLP URA5- Tegucigalpa, Honduras, 2015.

Abstract

Según el último informe (diciembre de 2010) del Programa Conjunto de las aciones Unidas sobre el VIH / sida y la Organización Mundial de la Salud, 34 millones de personas en todo el mundo sufren de la infección por VIH / sida. 2,7 millones personas se infectan cada año con el virus, y 1,8 millones de personas mueren por causas relacionadas con el sida. Entre 70 y 90% de los enfermos con infección por VIH presentan compromiso del SNC. El complejo C.neoformans/C. gattii es el grupo de levaduras más frecuentemente recuperado de muestras clínicas después de las del género Candida, (32,9% de 8.717 aislamientos). Además, la criptococosis es la segunda infección fúngica grave más común en ciertas regiones del mundo. Las infecciones causadas por C. neoformans var. grubii (serotipo A) y en menor grado, por C. neoformans var. neoformans (serotipo D) se ven en todo el mundo entre los huéspedes inmunocomprometidos. En Honduras se realizó un estudio en el año 1999 en el Hospital Escuela Universitario y el Instituto Cardiopulmonar (INCP) y se detectó que las micosis predominantes por orden de frecuencia fueron: candidiasis 63%, criptococosis 29% e histoplasmosis 8%; con predominio del sexo masculino con una relación de 1,7:1 en pacientes con VIH. El propósito de este estudio fue demostrar la presencia de Cryptococcus en nuestras ambientales y de pacientes, identificar las especies mediante pruebas bioquímicas y el medio CGB (canavanina, glicina, azul de bromotimol) que permite diferenciar C. neoformans de C. gattii. En la actualidad con el empleo de diversas técnicas moleculares como la PCR huella digital y el RFLP del gen URA5, se han reconocido ocho grandes tipos moleculares: VNI, VNII, VNIII y VNIV de C. neoformans y VGI, VGII, VGIII y VGIV para C. gattii (1). Mediante las técnicas moleculares ALFP y MSLT se identificó a VNB (2). La vigilancia molecular de los aislamientos del complejo C. neoformans/C. gattii es una herramienta epidemiológica de gran valor, teniendo en cuenta que la criptococosis ha adquirido un gran interés debido al número creciente de pacientes inmunocomprometidos en los últimos años y además al aumento de criptococosis debidas a C. gattii en individuos inmunocompetentes. Materiales y métodos. El enfoque del presente estudio fue cuantitativo, descriptivo, diseño no experimental. La población objeto de estudio fueron las levaduras de Cryptococcus, aisladas de muestras clínicas (principalmente LCR y esputo) a las que se les realizó un examen directo con tinta china y cultivos a 25 ºC y 37 ºC. Además se llevó a cabo la recolección de muestras ambientales: excretas de aves, detritos de árboles, hojas y flores en las áreas verdes del INCP. El muestreo se realizó mensualmente en un período de 3 meses, las muestras se procesaron según la técnica de Shields y Ajello, se sembraron en medio agar Níger, se incubaron a 28 °C y se observaron durante siete días. Se identificaron las colonias levaduriformes, mucoides con pigmentación marrón, estas fueron reaisladas en medio de Sabouraud para obtener cultivo puro y luego se realizó montaje con azul de lactofenol y con tinta china, prueba de ureasa en medio de Christensen y por micrométodo. Además se les realizaron las siguientes pruebas; crecimiento a 37 °C, prueba de asimilación de nitrato de potasio, sensibilidad a la cicloheximida, producción de tubo germinal y seudohifas. Luego se identificaron con las galerías API 20C Aux y se diferenciaron, el complejo C. neoformans del complejo C. gattii de acuerdo con los resultados en el medio CGB, según la metodología descrita por Meyer y Escandón. Resultados: Se analizaron 300 muestras ambientales, El 100% presentaban las características coloniales y celulares del género Cryptococcus, todas presentaban cápsula, eran ureasa positiva, crecieron a 37 ºC, fueron negativas a los nitratos, no formaron seudohifas y mostraron sensibilidad a la cicloheximida. Las 42 cepas de Cryptococcus aisladas en muestras ambientales y clínicas se identificaron mediante API 20C AUX de las cuales 34 (80,95%) fueron identificadas como C. neoformans, 7 (16,66 %) C. laurentii y 1 (2.38%) C.uniguttulatus. Según resultados en el medio de CGB: 10/42 (23.8%) pertenecen a C. gat- tii, 29/42 (69%) aislamientos C. neoformans, y las tres restantes: 1/42 (2.4%) C. unigutullatus y 2/42 (4.8%) C. laurentii. Los 29 aislamientos de C. neoformans y los de 10 C. gattii se genotipificaron por la técnica molecular RFLP del gen URA5. De los 29 de C. neoformans; 19 (65,5%) presentaron patrón molecular VNI de estas 12 (63,2%) aislamientos eran de origen ambiental (P0,0001) y 7 (36,8%) clínicos (P0,0001): 10 (34,5%) aislamientos presentaron patrón molecular VNII, 8 (80%) de origen ambiental (P = 0.0031) y 2 (20%) clínicos (P0,005) De los 29 (69,04%) aislamientos de C. neoformans, 19 fueron VNI y 10 VNII: 15 (51,7%)(12 VNI y 3 VNII) aislamientos, se obtuvieron en excretas de aves, 5 (17,24%) (5 VNII), en el ambiente y 9 (31,03%) (7 VNI y 2 VNII) en muestras de LCR. Se analizaron 10 aislamientos de C. gattii: 3 de origen clínico y 7 ambientales, de los 10 (23.81%) 7 fueron VGI y 3 VGII; 7 (70%) (6 VGI y 1 VG II), en muestras ambientales: 6 aislamientos (42,85%) en Eucalyptus camandulenses y 1 (7,14%) en hojas de Enterolobium cyclocarpum, y 3 (30 %) (1 VGI y 2 VGII) de origen clínico: 2 (20%) (2 VGII) en LCR y 1 (10%) (VGI) en esputo. 1(7,14%) de C. laurentii se encontró en ambiente y 1(7,14%) en LCR, y 1 (7,14%) de C. uniguttulatus en hojas de Eucalyptus camalduliensis. Con este estudio se demostró la presencia de C. neoformans / C.gattii en las muestras de origen clínico y ambiental, y la estrecha relación de C. neoformans con las excretas de aves Columba livia que construyen sus nidos en el espacio del cielorraso que cubre las salas de internación de pacientes con VIH-sida y pacientes con tuberculosis. Por otra parte, los aislamientos de C. gattii estarían en relación con los árboles de E. camalduliensis presentes en el área verde del INCP. Se evidenció la presencia de C. laurentii y de C. uniguttulatus especies que ocasionalmente pueden llegar a producir cuadros clínicos en individuos inmunocomprometidos. Se evaluó la capacidad de formación de cápsula en las cepas de origen clínico y ambientales. El tamaño inicial de la cápsula fue entre 0,5 a 2 micras y el tamaño de las células de 1 a 3 micras. Después de la inducción, el tamaño de la cápsula fue de 2 a 6 micras y el de las célula entre 6 y 14 micras, este último dato, lo presentó una cepa de C. gattii (VGI) de origen ambiental. C. neoformas (VNI y VNII), fueron capaces de desarrollar una cápsula de 6 a 12 micras. La morfología colonial de los 42 aislamientos fue: 6 (14,3%) lisas, 6 (14,3%) rugosas y 30 (71,4%) mucoides, de los aislamientos mucoides: 23 (54,7%) pertenecen a C. neoformans, 4 (13,3%) a C. gattii , 2 (6,6%) a C. laurentii y 1 (3,33%) a C. uniguttulatus. Se observó que de los aislamientos mucoides: 23 (54,7 %) pertenecen a C. neoformans (18 VNI y 5 VNII), 7 VNI de origen clínico y 11 ambientales: de los 5 slamientos VNII,fueron 2 clínicos y 3 ambientales. 4 (13,3%) aislamientos de C. gattii (4 VGI), 2 (6,6%) a C. laurentii y 1 (3,33%) C. uniguttulatus. De las 6 (14.3%) colonias rugosas, 5 (83,3%) eran de C. gattii (3 VGII y 2 VGI) y 1 (16,6%) de C. neoformans (VNI). De las 6 colonias lisas 5 (83,3%) eran aislamientos de C.neoformans (5 VNII) y 1 (16,6%) C. gattii (1 VGI). El aspecto mucoide, así como la presencia de colonias rugosas y el tamaño de la cápsula son indicadores de la capacidad patogénica. Se evaluó la producción de fenoloxidasa en diferentes medios de cultivo, utilizando varias semillas con propiedades bioquímicas similares a Helianthus annus (HA), agar semilla girasol. Se utilizó: Dioclea megacarpa (DM), Canavalia ensiformis (CE), Moringa oleífera (MO), Phaseolus vulgaris (PV), Mucuna pruriens (MP) y Linun usitatissimum (LU). Se estandarizaron con cepas de referencia de Cryptococcus, y se usó como control negativo una cepa de Candida albicans. El 50% de las cepas antes mencionadas, presentaron pigmento café de 3-6 horas en el medio MP, el 100% de las cepas presentaron pigmento café a las 48 horas de evidenciarse la colonia en todos los medios de cultivo. En cuanto a las cepas de C. neoformans y C. gattii, clínicas y ambientales: en el medio de cultivo MP: 29 (69%) de las cepas presentaron pigmento a las seis horas, entre estas están: 15 VNI, (10 de origen ambiental y 5 clínicos), 6 VNII (4 ambientales y 2 clínicos), 5 VGI (4 ambientales y 1 clínico) 3 VGII (1 ambiental y de origen 1 clínico). Diez (24%) a las doce horas: 4 VNI (2 ambientales y 2 clínicos), 4 VNII (ambientales) y 2 VGI (ambientales) y el 100% a las 24 horas después de evidenciada la colonia. En los medios de cultivo MD, CE y MO presentaron pigmento después de las 24 horas: 36 (85,7%), 35 (83,3%) y 36 (85,7%) respectivamente. Las 3 (7%) cepas: 1 C. uniguttulatus y 2 C. laurentii presentaron a una coloración tenue a las 72 horas. Aunque todos los medios de cultivo mostraron producción de pigmento, fue el medio (MP) Mucuna pruriens el que presentó cambio de color a partir de las tres horas de haberse evidenciado la colonia, además fue el más intenso. Se utilizaron cepas de referencia de Cryptococcus en la producción de la ureasa, los valores de las absorbancias fueron de 0,297 a 0,462. La valoración de la producción de ureasa en cepas de Cryptococcus de origen ambiental y clínico fue entre 0,179 y 0,458 de absorbancia. Las cepas de C. gattii, (VGI) de origen ambiental presentaron los niveles de absorbancia mas bajos, entre 0,179 y 0,218. Las cepas que presentaron las absorbancias mas elevadas, 0,389 y 0,458 fue C. neoformans (VNI) 7 cepas de origen ambiental y 4 de origen clínico. Dos cepas de C. gattii VGII de origen ambiental presentaron valores elevados, 0,373 y 0,376 de absorbancia. C. gattii aunque presente valores más bajos con respecto a C. neoformans u otras especies la producción de ureasa siempre juega un papel importante en su virulencia. Se estudiaron 13 aislamientos clínicos, 12 (92,3%) de LCR y 1(7,3%) de esputo. Nueve fueron C. neoformans, 7 VNI y 2 VNII. Tres fueron C. gattii, 1 VGI y 2 VGII. 1 aislamiento de C. laurentii en LCR. Las muestras fueron obtenidas de pacientes con un rango de edad entre 23 y 77 años con una media de 44,6 años. Los pacientes analizados durante este período 5 (38%) eran del sexo femenino y 8 (62%) del sexo masculino con una razón hombre/mujer de 1,5:1. Esto se explica porque en Honduras el VIH tiene una relación hombre/mujer de 1,1:1, por lo que la criptococosis afectaría más al sexo masculino. De 13 pacientes estudiados 2 (15,4%) presentaron recurrencia; 1 paciente presentó tres episodios a lo largo de 9 meses y otro falla de respuesta al tratamiento. Doce pacientes eran VIH positivos y 1 era VIH negativo con hipertensión e hiperlipidemia como enfermedad de base. Todos los pacientes fueron tratados con fluconazol y anfotericina B. Los pacientes que presentaron recurrencia tenían como antecedente abandono de tratamiento antirretroviral. En este estudio se demostró que la relación de C. neoformans / C. gattii es de 2,9:1, aunque en Centro y Sur América se han reportado una relación de 3,5:1, nuestros datos mantienen la misma tendencia de que la especie predominante es C. neoformans. En Oceanía y América del Norte, 1,5:1, donde C. gattii es la especie aislada predominante. En relación a C. gattii de las 10 cepas: 7 (70%) presentaron patrón molecular VGI (6 de origen ambiental y 1 de origen clínico), 3 (30%) patrón molecular VGII (1 de origen ambiental y 2 de origen clínico). Se encontró diferencias en el patrón predominante de C. gattii que, en nuestros resultados fue VGI mientras que los aislamientos del serotipo B son agrupados en su mayoría en el patrón VGII.