Procesos metabólicos asociados con la productividad y calidad de fruto en cultivares de manzano tempranos en regiones subtropicales de Argentina

Abstract

Esta tesis es la primera investigación a escala sobre los niveles de actividad de glicosidasas de pared celular en respuesta a una variedad de reguladores del crecimiento vegetal y de azúcares, y a concentraciones variables de sacarosa en cultivos de callos de frutos. Se detectaron actividades α-L-arabinofuranosidasa, α- y β-D-galactosidasa, α- y β-D-xilosidasa, y β-D-glucosidasa en las fracciones extraídas de cultivos de callos de manzana (Malus × domestica) con agua y con una solución reguladora con alta concentración salina. Las enzimas de la fracción liberada con NaCl están muy probablemente asociadas con la pared celular. La actividad resultó modulada diferentemente por doce reguladores del crecimiento vegetal (ácido indol-3-acético, ácido 1-naftalenacético, ácido indol-3-butírico, picloram, ácido 2,4-diclorofenoxiacético, cinetina, zeatina, N6-(2-isopentenil) adenina, 6-bencilaminopurina, tidiazurón, ácido abscísico, y ácido giberélico) adicionados a callos que habían perdido sus requerimientos por reguladores del crecimiento vegetal específicos (fenómeno de habituación). La presencia y concentración de sacarosa también moduló de diferentes maneras y en distinto grado la actividad de las seis glicósido hidrolasas vegetales extraídas de cultivos de callos de manzana, tanto de la fracción soluble en agua como de la fracción liberada con NaCl. La actividad β-D-glucosidasa se incrementó ante la carencia de sacarosa y la adición de sacarosa disminuyó esa actividad en ambas fracciones, en un medio basal de Murashige y Skoog sin (MS) o con (MC) reguladores del crecimiento vegetal. Las actividades α-L-arabinofuranosidasa, β-D-galactosidasa y β-D-xilosidasa de la fracción soluble en solución salina alcanzaron su nivel máximo cuando se adicionó sacarosa 0,045 M al medio MS, declinando a concentraciones mayores de sacarosa. La actividad α-D-galactosidasa y α-D-xilosidasa alcanzó el máximo nivel cuando se aplicó sacarosa 0,045 M y no disminuyó significativamente en callos suplementados con sacarosa 0,09 M. Cuando se analizaron los efectos de la presencia o ausencia de reguladores del crecimiento vegetal, las actividades β-D-glucosidasa, α-D-galactosidasa, β-D-galactosidasa, α-D-xilosidasa y β-D-xilosidasa de la fracción soluble en solución salina resultó ser más elevada en MS que en MC. La β-D-glucosidasa puede estar asociada positivamente con ciertas condiciones de estrés tales como la presencia de picloram, la ausencia de otros reguladores del crecimiento vegetal, o la carencia de ciertos azúcares (siendo una excepción el manitol, considerado inerte desde un punto de vista metabólico), indicando que las paredes celulares probablemente funcionen como un reservorio adicional de compuestos carbonados que provee hidratos de carbono bajo situaciones críticas. Para determinar si los efectos del azúcar son específicos de la sacarosa, se evaluaron otros azúcares (glucosa, fructosa, galactosa, maltosa, lactosa, rafinosa, sorbitol y manitol) con o sin el suplemento de reguladores del crecimiento vegetal. En general, los azúcares-alcohol (manitol, sorbitol) y algunos monosacáridos (fructosa y glucosa en particular) fueron mejores inductores de las actividades α-L-arabinofuranosidasa, β-D-galactosidasa y β-D-xilosidasa provenientes de la fracción salina, que los disacáridos (sacarosa, maltosa y lactosa) o que el trisacárido rafinosa. Esta tendencia no se extendió a todas las glicósido hidrolasas evaluadas dado que los callos suplementados con sacarosa mostraron en los extractos salinos una actividad α-D-galactosidasa más elevada que los suplementados con glucosa, galactosa, sorbitol o manitol. Estos resultados muestran que los azúcares suplementados como fuentes de carbono a los cultivos de tejido de callos también pueden modular la actividad de glicósido hidrolasas de pared celular. La modulación es diferente para cada glicosidasa, específica del azúcar y, al menos en el caso de la sacarosa, dependiente de la concentración. Los resultados también sugieren la existencia de interacciones regulatorias entre los reguladores del crecimiento vegetal y los azúcares como parte de una red intrincada de detección y señalización. La combinación de reguladores del crecimiento vegetal, el tipo y la concentración de azúcares deberían tenerse en consideración para maximizar la actividad de las glicósido hidrolasas para estudios enzimáticos adicionales. Las funciones estructurales de las paredes celulares no permiten por lo general variaciones pronunciadas del contenido total de pectinas y glicanos de matriz. Sin embargo, esta tesis provee evidencia de que la adición de diferentes reguladores del crecimiento vegetal puede determinar el metabolismo de la pared celular en cultivos de tejidos de callos. Cambios significativos en la composición de la pared celular tuvieron lugar en presencia de tres reguladores del crecimiento vegetal diferentes: picloram, ácido abscísico y ácido giberélico. Los cambios incluyeron alteraciones en el contenido de ácidos urónicos y de azúcares neutros totales, como también en los espectros de monosacáridos y en la relación arabinosa/galactosa. Asimismo, resultaron modificados significativamente los patrones de distribución del tamaño de los polímeros pécticos y hemicelulósicos. Estos estudios probablemente permitan nuevas oportunidades para definir medios de cultivo „hechos a medida‟ con fines específicos, dado que los niveles de reguladores del crecimiento vegetal son capaces de modificar la configuración de los polisacáridos de la pared celular en la biomasa vegetal generada de novo.

This thesis is the first broad-scale investigation on cell wall glycosidase activity levels in response to a range of plant growth regulators and sugars and to varying concentrations of sucrose in fruit callus cultures. α-L-Arabinofuranosidase, α- and β-D-galactosidase, α- and β-D-xylosidase, and β-D-glucosidase activities were detected in the soluble fraction extracted with water and in the NaCl-released fraction extracted with a high-salt concentration buffer from apple (Malus × domestica) callus cultures. Enzymes from the NaCl-released fraction are probably associated with the cell wall. The activity was found to be differently modulated by the addition of twelve plant growth regulators (indole-3-acetic acid, 1-naphthaleneacetic acid, indole-3-butyric acid, picloram, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, kinetin, zeatin, N6-(2-isopentenyl) adenine, 6-benzylaminopurine, thidiazuron, abscisic acid, and gibberellic acid) to callus that had lost their requirement for specific plant growth regulators (“habituation” phenomenon). Also, sucrose presence and concentration modulated in different ways and to different extents the activity of the six plant glycoside hydrolases extracted from apple callus cultures, both in the water soluble fraction and in the NaCl-released fraction. β-D-Glucosidase activity increased because of sucrose starvation and the addition of sucrose decreased β-D-glucosidase in both fractions, from calli grown in a Murashige and Skoog‟s basal medium with (MC) or without (MS) plant growth regulators. α-L-Arabinofuranosidase, β-D-galactosidase and β-D-xylosidase activities in the NaCl-released fraction reached a maximum when 0.045 M sucrose was added to the MS medium with an ensuing decline at higher sucrose concentrations. α-D-Galactosidase and α-D-xylosidase activities reached a maximum when 0.045 M sucrose was supplied and did not decline significantly in 0.09 M sucrose-supplied calli. When the effects of PGR presence or absence were analysed, β-D-glucosidase, α-D-galactosidase, β-D-galactosidase, α-D-xylosidase and β-D-xylosidase activities in the NaCl-released fraction were found to be higher in MS than in MC. β-D-glucosidase may be positively associated with certain stress conditions such as the presence of picloram, absence of other plant growth regulators, or sugar starvation (except for mannitol which is inert from a metabolic point of view), thus indicating that cell walls are likely to function as an additional carbon-storage pool that provides carbohydrates under critical situations. To assess whether sugar effects were sucrose-specific, other sugars (glucose, fructose, galactose, maltose, lactose, raffinose, sorbitol and mannitol) were tested, with or without PGR supplementation. In general, sugar alcohols (mannitol, sorbitol) and some monosaccharides (fructose and glucose in particular) were better inducers of α-L-arabinofuranosidase, β-D-galactosidase and β-D-xylosidase activities from the NaCl-released fraction than disaccharides (sucrose, maltose, and lactose) or the trisaccharide raffinose. This trend was not widespread to all the glycoside hidrolases assessed since sucrose-supplemented calli displayed higher α-D-galactosidase in the NaCl-released fraction than those supplemented with glucose, galactose, sorbitol or mannitol. These results show that sugars supplied to callus tissue cultures as a carbon source can also modulate glycoside hydrolase activity. Modulation is different for each glycoside hydrolase, sugar-specific and, at least in the case of sucrose, concentration-dependent. Results also suggest the existence of regulatory interactions between plant growth regulators and sugars as part of an intricate sensing and signalling network. Combination of plant growth regulator, sugar type and concentration should be taken into account to maximize each glycoside hydrolase activity for further enzyme studies. The structural functions of cell walls do not generally allow for pronounced variations of the total pectin and matrix glycan content. Nevertheless, this thesis provides evidence that the addition of different plant growth regulators can rule cell-wall metabolism in fruit callus cultures. Significant cell wall compositional changes took place in the presence of three different plant growth regulators: picloram, abscisic acid and gibberellic acid. Changes included alterations in the uronic acid and total neutral sugar content, as well as in the monosaccharide spectra and arabinose/galactose ratio. Also, the size distribution patterns of pectic and hemicellulosic polymers were significantly modified. These studies will probably grant new opportunities to define "tailor-made" culture media for specific purposes since the levels of plant growth regulators can modify the configuration of cell-wall polysaccharides in de novo built plant biomass.