Detección y diferenciación molecular de leptospira sp. utilizando diferentes técnicas de extracción de ADN

Abstract

Existen diversas estrategias diagnósticas para identificar leptospiras, siendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) una técnica de alta sensibilidad y especificidad. El presente trabajo tuvo como objetivo optimizar técnicas de extracción de ADN a partir de cultivos bacterianos y establecer condiciones de PCR multiplex para diferenciar leptospiras saprófitas de patógenas. Para ello se ensayaron técnicas de bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB) y hervido (boiling). Se analizaron dos secuencias de ácidos nucleicos, correspondientes a una fracción de un gen conservado en ambos grupos de bacterias (ARNr 16S) y otra procedente de una fracción de un gen (LipL32) presente sólo en especies de leptospiras patógenas, las cuales dieron amplicones de 474 y 430 pb respectivamente, utilizándose como controles positivos de amplificación muestras de cultivos bacterianos de Leptospira icteroahemorragiae, L. canicola y apatógena (Patoc I), utilizando agua como control negativo. Se concluyó que no existen diferencias en la perdurabilidad del ADN extraído a partir de cepas de referencia al comparar el método de digestión con el detergente CTAB y el de boiling y sus variantes. Considerando el más bajo costo y menor tiempo de desarrollo, este último resultó la mejor alternativa para la obtención de moldes para amplificación por PCR.

There are different diagnostic techniques to identify leptospiras; the polymerase chain reaction (PCR) is a method with high sensitivity and specificity. This study aimed to optimize DNA extraction from bacterial cultures and set conditions of multiplex PCR to differentiate saprophytes from pathogens leptospiras. For this, two techniques were tested: cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) and boiling. Two sequences were analyzed, corresponding to a fraction of a conserved gene in both groups of bacteria (16S rRNA) and another in a fraction of a gene present only in the pathogenic leptospiras (LipL32). Two amplicons of 474 and 430 pb respectively were obtained using cultures of Leptospira icteroahemorragiae, L. canicola and apathogenic (Patoc I) as positive controls and water as negative control. It was concluded that there was no difference in the durability of DNA extracted from reference strains compare with CTAB digestion and boiling and its variants. Considering its lower cost and time saving, the latter represents a good alternative for PCR amplification.