Identificación de leptospiras patógenas a nivel de especie en quirópteros colectados en la ciudad de Corrientes

Abstract

El año 2008 se agrupó a las Leptospiras en genoespecies saprofitas, patogénicas y de comportamiento intermedio. Las genoespecies patogénicas comprenden 8 especies. En su membrana externa se han identificado proteínas: OmpL, LipL y Líg, entre otras. Para un proyecto anterior, se capturaron murciélagos en la ciudad de Corrientes y mediante la reacción de PCR fue posible detectar Leptospiras en diferentes especies de quirópteros, aquí surge la necesidad de identificar especies de bacterias que fueron anteriormente clasificadas como patógenas o no patógenas, para ello se plantearon los siguientes objetivos: establecer las condiciones PCR para identificar especies Leptospiras sp. y aplicar las técnicas de PCR para detectar especies de Leptospiras en las muestras de tejido renal de quirópteros en las que se detectó previamente ADN de leptospiras patógenas cuyo ADN se hallaba debidamente acondicionado hasta su utilización. Los cultivos fueron examinados con el microscopio de campo obscuro a fin de evaluar: presencia de leptospiras, movilidad, contaminación y estado general del medio. Luego la extracción de ADN de las bacterias se ejecutó a partir de cultivos bacterianos de: L. interrogaos serogrupo Icteroahemorrágiae y serogrupo Canícola; L. Borgpeterseni serogrupo tarasovi; L. Kirschneri serogrupo cynopteri. Todas adquiridas del Instituto de Patobiología, INTA Castelar (Buenos Aires). La digestión fue realizada con detergente CTAB y por el método de hervido (boiling). Se seleccionaron 2 bacterias de circulación frecuente en nuestra región (L interrogaos y L. borgpeterseni) y una especie cuyo hallazgo fue documentado en murciélagos de otros países (L Kirschneri). Para el escaneo de los controles bacterianos se amplificó parte de los genes LipL32. Para el análisis de especies patógenas se analizaron genes OmpL1, los 4 primers seleccionados (OmpL1 intergroup A, 396pb; OmpLI Intergroup B, 406 pb; OmpL1 Borgpeter, 389 pb; OmpL1 Kirschner, 389 pb), permiten diferenciar especies de Leptospiras patógenas y el programa de ciclado empleado fue el descriptos por Reitstetter (2006). Existe una divergencia del gen, que divide a L. interrogaos en dos grupos, por lo que fue necesario realizar 2 PCR sencillas para identificar una sola especie. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en geles de agarosa 2% en buffer TBE1X, teñidos con bromuro de etidio, utilizando un marcador de peso molecular (cienmarker) y visualización por transiluminación UV. En el escaneo de los controles bacterianos, mediante análisis del gen L/pL32, se visualizó bandas de amplificación de 474 pb según lo esperado, con diferentes intensidad de banda, la nitidez fue sobresalientes en L. interrogaos y L. Borgpeterseni, en cambio L. Kirschneri demostró banda de amplificación tenue. Posteriormente, en el análisis del gen OmpL1 para identificar L. interrogaos y L. Borgpeterseni a partir de los cultivos bacterianos a fin de establecerlos como controles positivos, reveló bandas de amplificación nítidas y de buena intensidad en los controles cuyo ADN se obtuvo con detergente CTAB. Seguidamente, esta técnica fue aplicada a las 16 muestras de murciélagos que habían resultado detectables para leptospiras patógenas. Se inició la prueba, para detectar L. interrogaos del grupo A, luego el grupo B, a continuación la PCR para detectar L. Borgpeterseni. Todas se consideraron como no detectables para ambas especies de leptospiras, en todos los casos se observaron bandas de amplificación en los controles positivos y ausencia de banda en el control negativo. La reacción para detectar L. Kirschneri no fue realizada aun, debido a que se evidenció ADN de baja calidad, la visualización en microscopio de campo oscuro fue escasa con detección de 2 leptospiras circulantes. Estos resultados indican que las especies patógenas detectadas en los ejemplares colectados no pertenecen a las especies de L. interrogaos ni a L. Borgpeterseni, queda pendiente realizar la detección por biología molecular de la especie L. Kirschneri. Trabajos realizados en Australia, Perú, catalogan a los quirópteros como posibles reservónos de leptospiras, sin embargo en Brasil y Estados Unidos sostienen que no son importantes, aunque ya es conocido que los murciélagos pueden jugar un papel en la transmisión, aquí aun queda trabajo por hacer para lograr encontrar las especies que circulan en los quirópteros de nuestra región.