Análisis por biología molecular de la asociación entre Porphyromonas gingivalis y la enfermedad periodontal crónica

Abstract

Los seres humanos poseen un “microbioma oral dominado por bacterias anaerobias”. La mayoría de estos microorganismos exhiben en la cavidad oral un comportamiento simbiótico y una relación con el huésped basada en beneficios mutuos. Actualmente se postula que algunas especies bacterianas de la placa periodontopatogena se comportan como factores de riesgo significativos para la salud humana, ya que pueden exacerbar enfermedades inflamatorias crónicas como diabetes mellitus, enfermedades cardiovasculares, artritis reumatoidea, y pueden provocar bacteriemia y parto prematuro.

En estado de salud, en el surco gingival, existe una microbiota normal en equilibrio con el huésped. Un aumento tanto en cantidad como en diversidad de microorganismos, dará inicio a la gingivitis, que podrá proseguir o no hasta desarrollar periodontitis. La periodontitis es una enfermedad multifactorial de etiología bacteriana, si no se instaura un tratamiento, su evolución tiene como resultado la pérdida de la pieza dentaria. Es considerada una infección bacteriana mixta, causada por bacterias Gram-negativas anaerobias estrictas provenientes de la placa subgingival. Estos factores tienen acceso al tejido conectivo y al torrente sanguíneo a través del epitelio dañado de la bolsa periodontal.

La Periodontitis crónica (Pc) es la presentación más frecuente y es prevalente en adultos . Las especies bacterianas que forman la biopelícula periodontopaógena interactúan con los tejidos y las células del huésped causando la liberación de una amplia variedad de citocinas, quimiocinas y mediadores inflamatorios. Entre la variada ecología microbiana subgingival, algunas especies bacterianas se asocian al desarrollo y progreso de la enfermedad periodontal: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella spp, Treponema denticola, Tannerella forsythensis. Porphyromonas gingivalis (Pg). P. gingivalis es considerada uno de los agentes etiológicos más importantes en la periodontitis crónica. Posee factores de virulencia que causan la destrucción de los tejidos periodontales, directa o indirectamente mediante la modulación de la respuesta inflamatoria. Posee un gran potencial para colonizar e invadir tejidos y es considerada una pieza clave en la transformación de la biopelícula dental benigna en una comunidad microbiana patógena al perturbar o trastornar la inmunidad del huésped y prosperar en condiciones disbiótica. Favorece el desarrollo de una respuesta inflamatoria crónica y contribuye con los procesos de destrucción de tejido periodontal y hueso alveolar. Es uno de los microorganismos patobionte mejor documentados y el conocimiento actual sobre su mecanismo de infección y factores de virulencia, afirman su papel como un componente clave en la periodontitis crónica. En microbiología clínica, la identificación de los agentes patógenos es un requisito esencial para obtener un correcto diagnóstico y la aplicación posterior de un tratamiento adecuado. En la actualidad, la PCR (Polimerase Chain Reaction) es la técnica de Biología molecular más utilizada en microbiología clínica, sobre todo, cuando se intenta identificar patógenos de crecimiento tedioso in- vitro, anaerobios estrictos, crecimiento lento, y exigencias nutricionales como P. gingivalis.

La presencia de patógenos periodontales parece ser diferente en sujetos de diferente origen étnico y los factores geográficos también pueden influir en la distribución de estas especies. En nuestra región y en nuestro país, los datos científicos en referencia a la etiología y rol de las bacterias responsables de la enfermedad periodontal son escasos.

Objetivo: Establecer la prevalencia de Porphyromonas gingivalis en fluido gingival de pacientes adultos con periodontitis. Material y Método: Participaron en este estudio 45 pacientes de ambos sexos, sistémicamente saludables, con edades entre 35 y 65 años que asistieron al Módulo de Patología y Diagnóstico III de la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional del Nordeste. Los pacientes fueron diagnosticados clínicamente con periodontitis crónica de acuerdo con la American Association Periodontology. Como grupo control, se incluyeron en el proyecto 20 pacientes de ambos sexos sin enfermedad periodontal y sin enfermedades sistémicas. Cada participante firmó el Consentimiento informado aprobado por el Comité de Bioética de la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional del Nordeste. Se consideró la clasificación de enfermedad periodontal según lo sugerido por Escudero-Castaño y col. Se valoraron dos de los parámetros más importantes: profundidad de sondaje y pérdida de inserción clínica, para clasificar a la periodontitis crónica. Se seleccionaron dos sitios de muestreo, el de mayor profundidad de sondaje uno en la arcada superior y otro en la arcada inferior. Se tomaron muestras de líquido gingival con puntas de papel absorbente. Se introdujeron puntas de papel absorbente en el surco gingival del sitio elegido durante 60 segundos. Se transportaron luego en tubos Eppendorf bajo refrigeración almacenándose a -20 °C hasta su procesamiento. Se realizó la extracción de ADN utilizando el método de extracción con CTAB y posterior purificación. La prevalencia de P. gingivalis se determinó mediante la técnica de PCR de punto final. Se utilizó como control positivo la cepa de P. gingivalis ATCC 33277. La estrategia del ensayo se diseñó en forma simple y económica. Se utilizaron los cebadores descriptos en el protocolo de PCR de acuerdo con Quintero y col (2011) cuya banda se visualiza a 197 pares de bases (pb). Las secuencias de cebadores utilizadas fueron: Pg-1 F 5 -TGTAGATGACTGAAAACC-3’, Pg-2 R 5’- ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3'. Para comprobar la especificidad de los primers se ensayó la PCR utilizando ADN obtenido de la cepa ATCC® de P. gingivalis 33277™ y ADN de Staphylococcus aureus SARM (Staphylococcus aureus resistente a meticilina). Para comprobar la presencia de ADN bacteriano en las muestras de fluido gingival, se realizó una PCR de ARNr16S (procariotas). Para ello se utilizaron los cebadores BAK4 y BAK11, empleados universalmente para la detección de ARN ribosomal 16S en procariotas.

Los productos PCR se separaron por electroforesis en un gel de agarosa 1,8 % en buffer TBE1X más 3 pL de Gel Green 10,000X diluido 3X en agua destilada-desionizada y se visualizaron en foto documentador.

Resultados: La edad promedio de los pacientes evaluados fue de 40 ± 8,87 años y la distribución poblacional según el sexo fue de 64% para el sexo masculino y 36% para el femenino. El Índice de O’Leary, arrojó un promedio de 39,42 % en el sexo femenino y 41,90 % en el masculino. La distribución de frecuencias del grado de periodontitis en los pacientes evaluados fue de 13,3% de periodontitis leves, 46,7% moderadas y 40% de periodontitis severas. Se observó mayor frecuencia de periodontitis severa 72,2% y moderada 52,3% en pacientes de sexo masculino. La periodontitis leve se registró con mayor frecuencia en el sexo femenino, 66,7%. La prevalencia de P. gingivalis en la población estudiada fue del 44,4%. Se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas entre los grados de severidad de la periodontitis y la presencia de P. gingivalis (p = 0.0002 a = 5 %). Conclusión: En la población estudiada, la periodontitis prevaleció en el sexo masculino Las periodontitis moderadas se dieron con mayor frecuencia. En el sexo femenino se registró con mayor frecuencia la periodontitis leve. La prevalencia de P. gingivalis en esta población con periodontitis crónica es de 44,4%. Se observó un aumento de la prevalencia de P. gingivalis en relación a la severidad de la periodontitis.