Análisis por biología molecular de la asociación entre Porphyromonas gingivalis y la enfermedad periodontal crónica
Resumen
Los seres humanos poseen un “microbioma oral dominado por bacterias anaerobias”. La mayoría
de estos microorganismos exhiben en la cavidad oral un comportamiento simbiótico y una
relación con el huésped basada en beneficios mutuos. Actualmente se postula que algunas
especies bacterianas de la placa periodontopatogena se comportan como factores de riesgo
significativos para la salud humana, ya que pueden exacerbar enfermedades inflamatorias
crónicas como diabetes mellitus, enfermedades cardiovasculares, artritis reumatoidea, y pueden
provocar bacteriemia y parto prematuro.
En estado de salud, en el surco gingival, existe una microbiota normal en equilibrio con el
huésped. Un aumento tanto en cantidad como en diversidad de microorganismos, dará inicio a la
gingivitis, que podrá proseguir o no hasta desarrollar periodontitis. La periodontitis es una
enfermedad multifactorial de etiología bacteriana, si no se instaura un tratamiento, su evolución
tiene como resultado la pérdida de la pieza dentaria. Es considerada una infección bacteriana
mixta, causada por bacterias Gram-negativas anaerobias estrictas provenientes de la placa
subgingival. Estos factores tienen acceso al tejido conectivo y al torrente sanguíneo a través del
epitelio dañado de la bolsa periodontal.
La Periodontitis crónica (Pc) es la presentación más frecuente y es prevalente en adultos
.
Las especies bacterianas que forman la biopelícula periodontopaógena interactúan con los tejidos
y las células del huésped causando la liberación de una amplia variedad de citocinas, quimiocinas
y mediadores inflamatorios. Entre la variada ecología microbiana subgingival, algunas especies
bacterianas se asocian al desarrollo y progreso de la enfermedad periodontal: Aggregatibacter
actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella spp, Treponema denticola,
Tannerella forsythensis. Porphyromonas gingivalis (Pg). P. gingivalis es considerada uno de los
agentes etiológicos más importantes en la periodontitis crónica. Posee factores de virulencia que
causan la destrucción de los tejidos periodontales, directa o indirectamente mediante la
modulación de la respuesta inflamatoria. Posee un gran potencial para colonizar e invadir tejidos
y es considerada una pieza clave en la transformación de la biopelícula dental benigna en una
comunidad microbiana patógena al perturbar o trastornar la inmunidad del huésped y prosperar
en condiciones disbiótica. Favorece el desarrollo de una respuesta inflamatoria crónica y
contribuye con los procesos de destrucción de tejido periodontal y hueso alveolar. Es uno de los
microorganismos patobionte mejor documentados y el conocimiento actual sobre su mecanismo
de infección y factores de virulencia, afirman su papel como un componente clave en la
periodontitis crónica.
En microbiología clínica, la identificación de los agentes patógenos es un requisito esencial para
obtener un correcto diagnóstico y la aplicación posterior de un tratamiento adecuado. En la
actualidad, la PCR (Polimerase Chain Reaction) es la técnica de Biología molecular más utilizada
en microbiología clínica, sobre todo, cuando se intenta identificar patógenos de crecimiento
tedioso in- vitro, anaerobios estrictos, crecimiento lento, y exigencias nutricionales como P.
gingivalis.
La presencia de patógenos periodontales parece ser diferente en sujetos de diferente origen étnico
y los factores geográficos también pueden influir en la distribución de estas especies. En nuestra
región y en nuestro país, los datos científicos en referencia a la etiología y rol de las bacterias
responsables de la enfermedad periodontal son escasos.
Objetivo: Establecer la prevalencia de Porphyromonas gingivalis en fluido gingival de pacientes adultos con periodontitis.
Material y Método: Participaron en este estudio 45 pacientes de ambos sexos, sistémicamente
saludables, con edades entre 35 y 65 años que asistieron al Módulo de Patología y Diagnóstico
III de la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional del Nordeste. Los pacientes fueron
diagnosticados clínicamente con periodontitis crónica de acuerdo con la American Association
Periodontology. Como grupo control, se incluyeron en el proyecto 20 pacientes de ambos sexos
sin enfermedad periodontal y sin enfermedades sistémicas. Cada participante firmó el
Consentimiento informado aprobado por el Comité de Bioética de la Facultad de Odontología de
la Universidad Nacional del Nordeste. Se consideró la clasificación de enfermedad periodontal
según lo sugerido por Escudero-Castaño y col. Se valoraron dos de los parámetros más
importantes: profundidad de sondaje y pérdida de inserción clínica, para clasificar a la
periodontitis crónica. Se seleccionaron dos sitios de muestreo, el de mayor profundidad de sondaje
uno en la arcada superior y otro en la arcada inferior. Se tomaron muestras de líquido gingival
con puntas de papel absorbente. Se introdujeron puntas de papel absorbente en el surco gingival
del sitio elegido durante 60 segundos. Se transportaron luego en tubos Eppendorf bajo
refrigeración almacenándose a -20 °C hasta su procesamiento. Se realizó la extracción de ADN
utilizando el método de extracción con CTAB y posterior purificación. La prevalencia de P.
gingivalis se determinó mediante la técnica de PCR de punto final. Se utilizó como control
positivo la cepa de P. gingivalis ATCC 33277. La estrategia del ensayo se diseñó en forma simple
y económica. Se utilizaron los cebadores descriptos en el protocolo de PCR de acuerdo con
Quintero y col (2011) cuya banda se visualiza a 197 pares de bases (pb). Las secuencias de
cebadores utilizadas fueron: Pg-1 F 5 -TGTAGATGACTGAAAACC-3’, Pg-2 R 5’- ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3'. Para comprobar la especificidad de los primers se ensayó la
PCR utilizando ADN obtenido de la cepa ATCC® de P. gingivalis 33277™ y ADN de Staphylococcus aureus SARM (Staphylococcus aureus resistente a meticilina). Para comprobar
la presencia de ADN bacteriano en las muestras de fluido gingival, se realizó una PCR de
ARNr16S (procariotas). Para ello se utilizaron los cebadores BAK4 y BAK11, empleados
universalmente para la detección de ARN ribosomal 16S en procariotas.
Los productos PCR se separaron por electroforesis en un gel de agarosa 1,8 % en buffer TBE1X
más 3 pL de Gel Green 10,000X diluido 3X en agua destilada-desionizada y se visualizaron en
foto documentador.
Resultados: La edad promedio de los pacientes evaluados fue de 40 ± 8,87 años y la distribución
poblacional según el sexo fue de 64% para el sexo masculino y 36% para el femenino. El Índice
de O’Leary, arrojó un promedio de 39,42 % en el sexo femenino y 41,90 % en el masculino. La
distribución de frecuencias del grado de periodontitis en los pacientes evaluados fue de 13,3% de
periodontitis leves, 46,7% moderadas y 40% de periodontitis severas. Se observó mayor
frecuencia de periodontitis severa 72,2% y moderada 52,3% en pacientes de sexo masculino. La
periodontitis leve se registró con mayor frecuencia en el sexo femenino, 66,7%. La prevalencia de P. gingivalis en la población estudiada fue del 44,4%. Se obtuvieron diferencias
estadísticamente significativas entre los grados de severidad de la periodontitis y la presencia de P. gingivalis (p = 0.0002 a = 5 %).
Conclusión: En la población estudiada, la periodontitis prevaleció en el sexo masculino Las
periodontitis moderadas se dieron con mayor frecuencia. En el sexo femenino se registró con
mayor frecuencia la periodontitis leve. La prevalencia de P. gingivalis en esta población con
periodontitis crónica es de 44,4%. Se observó un aumento de la prevalencia de P. gingivalis en
relación a la severidad de la periodontitis.