Evaluación de la actividad antioxidante de de ingredientes derivados de caupí cultivado en el NEA

Abstract

El caupí (Vigna unguiculata [L.] Walp., sinónimo: Vigna sinensis [L.]) es una legumbre perteneciente a la familia Fabaceae y en la actualidad se encuentra ampliamente distribuida en el mundo. Este cultivo se utiliza para la alimentación humana y animal, como cultivo de cobertura y rotación y como abono verde. Sus semillas son consideradas un alimento con un elevado contenido de proteínas (23-27%), de buena calidad nutricional y fuente de aminoácidos esenciales, vitaminas del complejo B y minerales. Los radicales libres se forman en el organismo debido a una combinación de factores ambientales y biológicos. Entre los factores ambientales se encuentran la exposición a radiaciones, humo de cigarrillo, ozono, drogas químicas y pesticidas. En cuanto a los factores biológicos, durante las reacciones metabólicas endógenas en las células aeróbicas, se generan especies reactivas de oxígeno (ROS) como el anión superóxido (O2•- ), radical hidroxilo (OH• ), radical peroxilo (ROO• ), radical hidroxiperoxilo (HOO• ), peróxido de hidrógeno (H2O2) y peróxidos orgánicos, que son productos normales de la reducción biológica del oxígeno molecular. La producción de radicales libres es un proceso natural que puede ocurrir con o sin la intervención de enzimas, y sólo representa un problema de salud cuando los mecanismos de defensa del organismo no son capaces de neutralizarlos adecuadamente. Las acciones nocivas de los radicales libres sobre el organismo han promovido la búsqueda de moléculas con propiedades antioxidantes como potenciales agentes terapéuticos, unido a la creciente preocupación por los efectos tóxicos producidos por los antioxidantes sintéticos utilizados en la preservación de alimentos; esto refuerza la urgencia de obtener sustancias antioxidantes menos tóxicas y de amplia utilidad en las industrias alimentaria, cosmética y farmacéutica. En este sentido, el caupí constituye una potencial fuente de compuestos debido a que posee gran variedad de metabolitos secundarios como respuesta a estímulos o condiciones ambientales, entre ellos, sustancias con capacidad captadora de radicales libres tales como los compuestos fenólicos y que a partir de sus proteínas se pueden generar péptidos antioxidantes que pueden limitar también el daño oxidativo, tanto en alimentos preparados (usándolos como antioxidantes naturales), así como al proteger de la oxidación a las células del organismo cuando éstos son ingeridos en la dieta. El objetivo general de esta tesis fue generar nuevos conocimientos sobre las propiedades fisicoquímicas y biológicas antioxidantes de ingredientes derivados de caupí, de sus proteínas, péptidos y compuestos fenólicos, a efectos de poder incorporarlos como suplemento o ingrediente en productos alimentarios fabricados para fines específicos o bien su uso como potenciales componentes benéficos para la salud. A partir de la harina de las semillas de caupí, se obtuvieron aislados proteicos por extracción alcalina (a pH 8,0 y 10,0) y posterior precipitación isoeléctrica. Los aislados proteicos obtenidos se nombraron A8 y A10, de acuerdo con el pH de extracción utilizado. En primer lugar, se utilizaron dos relaciones diferentes de alcalasa y aislados para obtener hidrolizados de proteínas de caupí con bajo (LH) o alto (HH) grado de hidrólisis (GH). Los hidrolizados proteicos obtenidos se nombraron A8LH, A10LH, A8HH y A10HH. A efectos de determinar los cambios estructurales de las proteínas como consecuencia de la hidrólisis enzimática, se estudiaron el perfil polipeptídico y las características conformacionales de las estructuras secundaria y terciaria. Los resultados obtenidos por electroforesis, cromatografía de exclusión molecular, espectroscopias de fluorescencia e infrarrojo muestran que el tratamiento con alcalasa para obtener un bajo GH afectó en mayor medida a A10 que a A8. Mientras que para obtener un alto GH, se evidenciaron cambios fisicoquímicos y estructurales donde no se evidenció incidencia del pH inicial de extracción de las proteínas. Además, los hidrolizados LH presentaron un incremento de la solubilidad en la zona del punto isoeléctrico de las proteínas. Las moléculas antioxidantes pueden reaccionar mediante múltiples mecanismos, por lo que fue importante evaluar la actividad antioxidante de los derivados del caupí utilizando diferentes métodos (ABTS, ORAC y HORAC). A8LH y A10LH presentaron un aumento similar de la actividad de eliminación de radicales (contra los radicales ABTS•+ y peroxilo) y de la capacidad de prevenir la formación de radicales OH•, respecto a A8 y A10, respectivamente. La capacidad antioxidante fue mayor a mayor GH alcanzado y se debió principalmente a la presencia de péptidos de entre 1,8 y 6,5 kDa, obtenidos por fraccionamiento mediante cromatografía de exclusión molecular, los cuales mostraron elevada actividad de eliminación de radicales peroxilo. De la fracción cromatográfica de A10HH que presentó mayor actividad antioxidante, se identificaron por espectrometría de masas péptidos trípticos provenientes de cuatro proteínas de caupí. Consultando bases de datos de péptidos bioactivos y teniendo en cuenta la especificidad de corte de la alcalasa, se lograron proponer secuencias de péptidos antioxidantes provenientes de su hidrólisis. Considernado que ambos aislados presentaron similar comportamiento en la solubilidad y en las propiedades antioxidantes luego de la hidrólisis y, que la extracción a pH 10 de las proteínas (más desnaturalizadas que a pH 8) facilitó la hidrólisis con alcalasa a bajas concentraciones, se decidió continuar con la digestión gastrointestinal simulada (DGIS) del aislado A10 y la harina de caupí. Se utilizó el método internacionalmente consensuado por la acción COST INFOGEST (2019). La DGIS ocasionó menor grado de proteólisis en la harina (HD) que en el aislado proteico (A10D). Los perfiles electroforéticos y cromatográficos mostraron una disminución o desaparición de las fracciones de mayor tamaño molecular, generándose péptidos más pequeños y aminoácidos libres, cambios que se notaron en mayor medida en A10D. El proceso de DGIS produjo en HD y A10D un importante aumento de la capacidad de eliminación de radicales (ABTS y peroxilo) y en la prevención de la oxidación del Fe2+ (FRAP). Si bien HD y A10D mostraron la capacidad de prevenir la formación de radicales OH• (HORAC), la harina antes de la DGIS tuvo una actividad superior, indicando el aporte de algunos componentes solubles activos (ausentes en el aislado). Adicionalmente, para estudiar la actividad antioxidante intracelular en células Caco-2 TC7, se recurrió al uso de la resina colestiramina a fin de remover previamente las sales biliares y obtener fracciones bioaccesibles no citotóxicas de HD y A10D. Se demostró la inhibición del contenido de ROS en un 77% para ambos digeridos, mostrando A10D una mayor actividad a una concentración 3 veces menor, respecto de HD. Los digeridos se sometieron a cromatografía de exclusión molecular para obtener fracciones enriquecidas en péptidos con alta actividad antioxidante. En HD dos fracciones (rango de PM entre 1,09 y 0,17 kDa) presentaron elevada actividad por ORAC mientras que en A10D, la fracción con PM entre 1,1 y 0,68 kDa, mostró la mayor actividad por ABTS y ORAC. A partir de las fracciones con PM entre 0,68 y 2,5 kDa que presentaron la mayor actividad por el método de ORAC, se lograron identificar por espectrometría de masas, secuencias de péptidos trípticos que provenían de la digestión de 11 y 24 proteínas de caupí, halladas en los picos cromatográficos 3D de A10D y 4D A10D, respectivamente. Para estudiar los compuestos fenólicos (CF) presentes en H y A10 y sus digeridos por DGIS (HD y A10D) se obtuvieron extractos con distintos solventes: mezcla metanol:agua 70:30 (MA), metanol:HCl 1,2 M 50:50 (MH), y a partir de la mezcla de extracción metanolacetona-agua 7:7:6 (MAA) se obtuvieron las fracciones CFL (CF libres), CFE (CF esterificados) y CFLP (CF ligados a proteínas). Se observó que el tipo y cantidad de CF extraídos estuvo influenciado por los métodos de extracción. El contenido de CF totales cuantificados por el método de Folin y la cantidad de CF identificados por RP-HPLC presentaron diferencias ya que en H y en A10 existen otros compuestos no fenólicos capaces de reaccionar con el reactivo Folin. En A10 hay mayor proporción de péptidos o aminoácidos (respecto a H) que podrían reaccionar. En este sentido, si bien el contenido de CF totales no presentó diferencias significativas respecto a la H en el extracto MA, se observó la pérdida de algunos ácidos fenólicos y flavonoides solubles durante la preparación de A10 y, la cantidad cuantificada por RP-HPLC fue menor. Esto podría atribuirse a su solubilización o modificación química en un medio alcalino, y/o a su absorción en la fracción insoluble.

El caupí (Vigna unguiculata [L.] Walp., sinónimo: Vigna sinensis [L.]) es una legumbre perteneciente a la familia Fabaceae y en la actualidad se encuentra ampliamente distribuida en el mundo. Este cultivo se utiliza para la alimentación humana y animal, como cultivo de cobertura y rotación y como abono verde. Sus semillas son consideradas un alimento con un elevado contenido de proteínas (23-27%), de buena calidad nutricional y fuente de aminoácidos esenciales, vitaminas del complejo B y minerales. Los radicales libres se forman en el organismo debido a una combinación de factores ambientales y biológicos. Entre los factores ambientales se encuentran la exposición a radiaciones, humo de cigarrillo, ozono, drogas químicas y pesticidas. En cuanto a los factores biológicos, durante las reacciones metabólicas endógenas en las células aeróbicas, se generan especies reactivas de oxígeno (ROS) como el anión superóxido (O2•- ), radical hidroxilo (OH• ), radical peroxilo (ROO• ), radical hidroxiperoxilo (HOO• ), peróxido de hidrógeno (H2O2) y peróxidos orgánicos, que son productos normales de la reducción biológica del oxígeno molecular. La producción de radicales libres es un proceso natural que puede ocurrir con o sin la intervención de enzimas, y sólo representa un problema de salud cuando los mecanismos de defensa del organismo no son capaces de neutralizarlos adecuadamente. Las acciones nocivas de los radicales libres sobre el organismo han promovido la búsqueda de moléculas con propiedades antioxidantes como potenciales agentes terapéuticos, unido a la creciente preocupación por los efectos tóxicos producidos por los antioxidantes sintéticos utilizados en la preservación de alimentos; esto refuerza la urgencia de obtener sustancias antioxidantes menos tóxicas y de amplia utilidad en las industrias alimentaria, cosmética y farmacéutica. En este sentido, el caupí constituye una potencial fuente de compuestos debido a que posee gran variedad de metabolitos secundarios como respuesta a estímulos o condiciones ambientales, entre ellos, sustancias con capacidad captadora de radicales libres tales como los compuestos fenólicos y que a partir de sus proteínas se pueden generar péptidos antioxidantes que pueden limitar también el daño oxidativo, tanto en alimentos preparados (usándolos como antioxidantes naturales), así como al proteger de la oxidación a las células del organismo cuando éstos son ingeridos en la dieta. El objetivo general de esta tesis fue generar nuevos conocimientos sobre las propiedades fisicoquímicas y biológicas antioxidantes de ingredientes derivados de caupí, de sus proteínas, péptidos y compuestos fenólicos, a efectos de poder incorporarlos como suplemento o ingrediente en productos alimentarios fabricados para fines específicos o bien su uso como potenciales componentes benéficos para la salud. A partir de la harina de las semillas de caupí, se obtuvieron aislados proteicos por extracción alcalina (a pH 8,0 y 10,0) y posterior precipitación isoeléctrica. Los aislados proteicos obtenidos se nombraron A8 y A10, de acuerdo con el pH de extracción utilizado. En primer lugar, se utilizaron dos relaciones diferentes de alcalasa y aislados para obtener hidrolizados de proteínas de caupí con bajo (LH) o alto (HH) grado de hidrólisis (GH). Los hidrolizados proteicos obtenidos se nombraron A8LH, A10LH, A8HH y A10HH. A efectos de determinar los cambios estructurales de las proteínas como consecuencia de la hidrólisis enzimática, se estudiaron el perfil polipeptídico y las características conformacionales de las estructuras secundaria y terciaria. Los resultados obtenidos por electroforesis, cromatografía de exclusión molecular, espectroscopias de fluorescencia e infrarrojo muestran que el tratamiento con alcalasa para obtener un bajo GH afectó en mayor medida a A10 que a A8. Mientras que para obtener un alto GH, se evidenciaron cambios fisicoquímicos y estructurales donde no se evidenció incidencia del pH inicial de extracción de las proteínas. Además, los hidrolizados LH presentaron un incremento de la solubilidad en la zona del punto isoeléctrico de las proteínas. Las moléculas antioxidantes pueden reaccionar mediante múltiples mecanismos, por lo que fue importante evaluar la actividad antioxidante de los derivados del caupí utilizando diferentes métodos (ABTS, ORAC y HORAC). A8LH y A10LH presentaron un aumento similar de la actividad de eliminación de radicales (contra los radicales ABTS•+ y peroxilo) y de la capacidad de prevenir la formación de radicales OH•, respecto a A8 y A10, respectivamente. La capacidad antioxidante fue mayor a mayor GH alcanzado y se debió principalmente a la presencia de péptidos de entre 1,8 y 6,5 kDa, obtenidos por fraccionamiento mediante cromatografía de exclusión molecular, los cuales mostraron elevada actividad de eliminación de radicales peroxilo. De la fracción cromatográfica de A10HH que presentó mayor actividad antioxidante, se identificaron por espectrometría de masas péptidos trípticos provenientes de cuatro proteínas de caupí. Consultando bases de datos de péptidos bioactivos y teniendo en cuenta la especificidad de corte de la alcalasa, se lograron proponer secuencias de péptidos antioxidantes provenientes de su hidrólisis. Considernado que ambos aislados presentaron similar comportamiento en la solubilidad y en las propiedades antioxidantes luego de la hidrólisis y, que la extracción a pH 10 de las proteínas (más desnaturalizadas que a pH 8) facilitó la hidrólisis con alcalasa a bajas concentraciones, se decidió continuar con la digestión gastrointestinal simulada (DGIS) del aislado A10 y la harina de caupí. Se utilizó el método internacionalmente consensuado por la acción COST INFOGEST (2019). La DGIS ocasionó menor grado de proteólisis en la harina (HD) que en el aislado proteico (A10D). Los perfiles electroforéticos y cromatográficos mostraron una disminución o desaparición de las fracciones de mayor tamaño molecular, generándose péptidos más pequeños y aminoácidos libres, cambios que se notaron en mayor medida en A10D. El proceso de DGIS produjo en HD y A10D un importante aumento de la capacidad de eliminación de radicales (ABTS y peroxilo) y en la prevención de la oxidación del Fe2+ (FRAP). Si bien HD y A10D mostraron la capacidad de prevenir la formación de radicales OH• (HORAC), la harina antes de la DGIS tuvo una actividad superior, indicando el aporte de algunos componentes solubles activos (ausentes en el aislado). Adicionalmente, para estudiar la actividad antioxidante intracelular en células Caco-2 TC7, se recurrió al uso de la resina colestiramina a fin de remover previamente las sales biliares y obtener fracciones bioaccesibles no citotóxicas de HD y A10D. Se demostró la inhibición del contenido de ROS en un 77% para ambos digeridos, mostrando A10D una mayor actividad a una concentración 3 veces menor, respecto de HD. Los digeridos se sometieron a cromatografía de exclusión molecular para obtener fracciones enriquecidas en péptidos con alta actividad antioxidante. En HD dos fracciones (rango de PM entre 1,09 y 0,17 kDa) presentaron elevada actividad por ORAC mientras que en A10D, la fracción con PM entre 1,1 y 0,68 kDa, mostró la mayor actividad por ABTS y ORAC. A partir de las fracciones con PM entre 0,68 y 2,5 kDa que presentaron la mayor actividad por el método de ORAC, se lograron identificar por espectrometría de masas, secuencias de péptidos trípticos que provenían de la digestión de 11 y 24 proteínas de caupí, halladas en los picos cromatográficos 3D de A10D y 4D A10D, respectivamente. Para estudiar los compuestos fenólicos (CF) presentes en H y A10 y sus digeridos por DGIS (HD y A10D) se obtuvieron extractos con distintos solventes: mezcla metanol:agua 70:30 (MA), metanol:HCl 1,2 M 50:50 (MH), y a partir de la mezcla de extracción metanolacetona-agua 7:7:6 (MAA) se obtuvieron las fracciones CFL (CF libres), CFE (CF esterificados) y CFLP (CF ligados a proteínas). Se observó que el tipo y cantidad de CF extraídos estuvo influenciado por los métodos de extracción. El contenido de CF totales cuantificados por el método de Folin y la cantidad de CF identificados por RP-HPLC presentaron diferencias ya que en H y en A10 existen otros compuestos no fenólicos capaces de reaccionar con el reactivo Folin. En A10 hay mayor proporción de péptidos o aminoácidos (respecto a H) que podrían reaccionar. En este sentido, si bien el contenido de CF totales no presentó diferencias significativas respecto a la H en el extracto MA, se observó la pérdida de algunos ácidos fenólicos y flavonoides solubles durante la preparación de A10 y, la cantidad cuantificada por RP-HPLC fue menor. Esto podría atribuirse a su solubilización o modificación química en un medio alcalino, y/o a su absorción en la fracción insoluble. Luego de la DGIS, la cantidad total de CF detectados por RP-HPLC presentó modificaciones en H y A10 con todas las extracciones realizadas. Se presentaron incrementos en HD con las extracciones MA, MH y CFE de MAA y en A10D con las extracciones de CFL y CFLP del extracto MAA. Estos cambios se debieron principalmente a aumentos de ácido gálico y quercetina-3-galactósido en el sistema MA de HD, de (-)-epigalocatequina en el sistema MH de HD y de quercetina-3-glucósido en CFE y quercetina-3-galactósido en CFLP en el extracto MAA de A10D. La actividad antioxidante medida por ABTS y ORAC presentó incrementos luego de la DGIS para los extractos MA y MH de HD y A10D y para la extracción con mezcla MAA, se observó aumento en la actividad antioxidante para los extractos de CFE de ambos digeridos. Finalmente, se evaluó el efecto de la incorporación de H, A10 y A10LH en formulaciones cárnicas tipo hamburguesa, en la estabilidad del pH, la inhibición de las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, el color y los parámetros de textura durante su almacenamiento refrigerado. Los mejores resultados fueron los obtenidos con formulaciones con carne vacuna con la incorporación de A10 y A10LH al 4%, ya que durante el almacenamiento en condiciones de refrigeración inhibieron la oxidación de lípidos, y presentaron cambios beneficiosos en los parámetros de color y textura. En este trabajo de tesis se han logrado generar nuevos conocimientos sobre las propiedades fisicoquímicas y biológicas antioxidantes de ingredientes derivados de caupí variedad Cuarentón: harina, aislados e hidrolizados proteicos, péptidos y compuestos fenólicos. Se espera que estos conocimientos puedan ser transferidos a efectos de ser incorporados como suplementos o ingredientes funcionales en productos alimentarios fabricados para fines específicos o bien su uso como potenciales componentes benéficos para la salud.