Selección y caracterización molecular de BAL productoras de GABA para la elaboración de productos lácteos funcionales

Abstract

El ácido γ-aminobutírico (GABA) es un aminoácido no proteico con un rol destacado en distintas funciones fisiológicas y muy extendido en la naturaleza en plantas y animales. Se cree que, en el hombre, el GABA tiene efectos beneficiosos sobre la salud y el bienestar. En el sistema nervioso central actúa como el mayor inhibidor del impulso neurotransmisor con funciones calmantes y relajantes. Además, el GABA tiene efectos hipotensores, diuréticos y antidiabéticos. Muchos microorganismos pueden producir GABA a partir del ácido glutámico, incluyendo diversas bacterias del ácido láctico (BAL). La producción de GABA por BAL podría utilizarse en el desarrollo de alimentos fermentados funcionales. En este estudio, inicialmente se analizó la capacidad de producción de GABA por cepas acido lácticas aisladas de leche cruda y productos lácteos tradicionales elaborados con leche cruda sin cultivos iniciadores. Este ensayo se llevó a cabo en medios de cultivo suplementados con glutamato monosódico (GMS) al 1% utilizando un método enzimático (GABasa). Entre las cepas que resultaron productoras en este ensayo, el estudio se centró en las especies Lactococcus (L.) lactis y Streptococcus (S.) thermophilus que produjeron >1 mM de GABA. La producción de GABA se confirmó mediante cultivos adicionados del precursor, GMS, seguida de cuantificación por cromatografía líquida HPLC. Utilizando cebadores específicos de especie, el gen que codifica la glutamato descarboxilasa (gadB) se amplificó por PCR en los productores de GABA analizados. Las secuencias de amplicones se compararon entre sí y con las contenidas en bases de datos. Posteriormente, se seleccionó un grupo de cepas productoras de GABA, y se determinaron sus perfiles fenotípicos, tecnológicos y de seguridad alimentaria. En cuatro cepas de cada especie se realizó el análisis del genoma, el cual proporcionó la base genética de la mayoría de las propiedades fenotípicas analizadas. El operón que alberga el gen gadB está codificado en el cromosoma en todas las cepas y mostró el mismo contenido génico y el mismo orden de genes que los reportados, respectivamente, para L. lactis y S. thermophilus. En esta última especie, el operón está flanqueado (como en la mayoría de las cepas de esta especie) por copias completas o truncadas de secuencias de inserción, lo que sugiere una adquisición mediante transferencia horizontal de genes. Los genomas de tres cepas de L. lactis y dos de S. thermophilus mostraron un gen que codifica una proteinasa caseinolítica (PrtP en L. lactis y PrtS en S. thermophilus). Estas cepas se crecieron en leche formando un coágulo de buena apariencia y un atractivo sabor ácido. También produjeron GABA a partir de GMS en este medio. Se identificaron dos cepas de L. lactis pertenecientes a la biovar. diacetylactis; estas utilizan el citrato de la leche y producen cantidades significativas de acetoína. Ninguna de las cepas mostró resistencia adquirida a los antibióticos ensayados, ni sus genomas albergaban genes de resistencia transferibles, tampoco genes implicados en toxicidad, virulencia o patogenicidad. En conjunto, los resultados sugerían que las ocho cepas seleccionadas pueden considerarse candidatas para su uso como cultivos iniciadores o adjuntos para la fabricación de productos lácteos fermentados enriquecidos en GABA. Su utilidad real como fermentos se comprobó mediante elaboraciones experimentales de leche fermentada (las cuatro cepas de L. lactis) y de yogur (las cepas de S. thermophilus en combinación con una cepa de Lactobacillus delbrueckii) a partir de leche adicionada de GMS. Sin embargo, para un uso racional de estos cultivos funcionales, es necesario conocer los mecanismos involucrados en la síntesis y regulación de GABA. Por ello, finalmente, se llevó a cabo un análisis transcripcional de los genes gadB y gadC en la cepa S. thermophilus St 8.1 en condiciones que simulan las de fabricación y maduración de productos lácteos fermentados. Mediante PCR cuantitativa con transcriptasa inversa (RT-qPCR),se observó que para la activación del operón GAD se requiere un pH inferior a 5,0. Además, la expresión de los genes gad se ve afectada de manera diferente por señales específicas del entorno: aumenta en presencia de NaCl y disminuye en presencia de lactosa.

γ-aminobutyric acid (GABA) is a non-protein amino acid with a prominent role in various physiological functions. It is widespread in nature, found in both plants and animals. In humans, GABA is believed to have beneficial effects on health and well-being. In the central nervous system, GABA acts as the major neurotransmitter impulse inhibitor, providing calming and relaxing functions. Additionally, GABA exhibits hypotensive, diuretic, and antidiabetic effects. Many microorganisms can produce GABA from glutamic acid, including various lactic acid bacteria (LAB). GABA production by LAB can be used in developing functional fermented foods. In this study, we initially analyzed the GABA production capacity of lactic acid strains isolated from raw milk and traditional dairy products made from raw milk without starter cultures. This assay was conducted in culture media supplemented with 1% monosodium glutamate (MSG) using an enzymatic method (GABase). Among the strains that produced GABA in this assay, the study focused on strains of the species Lactococcus (L.) lactis and Streptococcus (S.) thermophilus that produced >1 mM of GABA. GABA production was confirmed through cultures with the precursor MSG, followed by quantification via liquid chromatography HPLC. Using species-specific primers, the gene encoding glutamate decarboxylase (gadB) was amplified by PCR in the analyzed GABA producers. Amplicon sequences were compared with each other and with those contained in databases. Subsequently, a group of GABA-producing strains was selected, and their phenotypic, technological, and food safety profiles were determined. The genome analysis of four strains of each species provided the genetic basis for most of the phenotypic properties analyzed. The operon harboring the gadB gene is encoded in the chromosome in all strains and showed the same gene content and gene order as reported for L. lactis and S. thermophilus. In the latter species, the operon is flanked (as in most strains of this species) by complete or truncated copies of insertion sequences, suggesting acquisition through horizontal gene transfer. The genomes of three L. lactis strains and two S. thermophilus strains showed a gene encoding a caseinolytic proteinase (PrtP in L. lactis and PrtS in S. thermophilus). These strains grew in milk, forming a well-appearing coagulum and an attractive acidic flavor. They also produced GABA from MSG in this medium. Two L. lactis strains belonging to the diacetylactis biovar were identified; these utilize milk citrate and produce significant amounts of acetoin. None of the strains showed acquired resistance to the tested antibiotics, nor did their genomes harbor transferable resistance genes, or genes involved in toxicity, virulence, or pathogenicity. Overall, the results suggested that the eight selected strains can be considered candidates for use as starter or adjunct cultures for the production of GABA-enriched fermented dairy products. Their actual usefulness as ferments was tested through experimental preparations of fermented milk (the four L. lactis strains) and yogurt (the S. thermophilus strains in combination with a Lactobacillus delbrueckii strain) from milk supplemented with MSG. However, for the rational use of these functional cultures, it is necessary to understand the mechanisms involved in GABA synthesis and regulation. Therefore, a transcriptional analysis of the gadB and gadC genes was carried out in the S. thermophilus St 8.1 strain under conditions simulating the manufacture and maturation of fermented dairy products. Using quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR), it was observed that activation of the GAD operon requires a pH below 5.0. Additionally, the expression of the gad genes is differently affected by specific environmental signals: it increases in the presence of NaCl and decreases in the presence of lactose.