Aspergillus sección Fumigati no A. fumigatus : identificación polifásica y desarrollo de un método rápido de identificación molecular

Abstract

La aspergilosis es una infección fúngica causada por hongos del género Aspergillus. La especie más frecuentemente asociada a infecciones humanas es Aspergillus fumigatus. Sin embargo, la Sección Fumigati hoy contiene al menos 59 especies, muchas de las cuales han sido reportadas como agentes de aspergilosis que, en algunos casos, pueden ser refractarias al tratamiento antifúngico. El objetivo de este trabajo fue conocer las especies de Aspergillus Sección Fumigati diferentes de A. fumigatus circulantes en Argentina y desarrollar un método rápido de qPCR-HRM que permita reducir los tiempos de identificación de los aislados recuperados en cultivo. Para ello, se re-identificaron todos los aislados de A. sección Fumigati conservados en la colección de cultivos de hongos de interés biomédio del Departamento Micología (DMic) entre 1984 y 2019. Se estudiaron sus caracteres morfológicos y su capacidad de crecimiento a 50°C. Todos los aislados que no crecieron a esa temperatura y/o presentaron morfología aberrante, se identificaron por Multi Locus Sequence Typing (MLST) con las secuencias de la región ITS1-5.8S-ITS2 (ITS) del ADNr y los genes -Tubulina (BenA) y Calmodulina (CaM); y se analizaron sus perfiles de sensibilidad a los antifúngicos. Además, se diseñaron primers específicos para una región de 58 pb del gen CaM y se analizó un total de 93 muestras de ADN de Aspergillus de 20 especies diferentes, por qPCR-HRM y se analizaron las temperaturas de melting (Tm) para la diferenciación entre las especies de la sección Fumigati. Se analizaron 356 aislados pertenecientes a 315 pacientes, derivadas para su identificación entre 1984 y 2019. Estos aislados fueron recuperados mayormente de esputo (37%), lavado broncoalveolar (19%) y biopsia de pulmón (15%). De los 356 aislados, 32 fueron clasificados como A. sección Fumigati no fumigatus: se identificaron 13 aislados (7 pacientes) de A. udagawae, 6 aislados (6 pacientes) de A. lentulus, 2 aislados (2 pacientes) de A. fumigatiaffinis, 2 aislados (2 pacientes) de A. felis, 6 aislados 5 (5 pacientes y 1 ambiental) de A. hiratsukae, 2 aislados (1 paciente) de A. thermomutatus y 1 aislado (clínico-ambiental) de A. turcosus. Los valores de concentración mínima inhibitoria (CIM) obtenidos con A. felis, A. thermomutatus y A. turcosus para los nueve antifúngicos evaluados fueron ≤1 mg/L. Algo similar ocurrió con A. fumigatiaffinis con la excepción de anfotericina B (AB) donde se obtuvieron valores de CIM de 2 y 4 mg/L para los aislados de esta especie. Por el contrario, con A. udagawae y A. lentulus se obtuvieron valores de CIM más elevados, principalmente con AB y los triazoles. Para A. hiratsukae los valores de CIM fueron ≤0,5 mg/L para todos los antifúngicos evaluados a excepción de una cepa que mostró CIM 1 mg/L para isavuconazol. Para A. fumigatus observamos resistencia frente a la anfotericina B en 3 cepas, mientras que para el resto de los antifúngicos no se encontraron resistencias, los valores de CIM fueron ≤1 mg/L. Los antifúngicos más activos fueron itraconazol, voriconazol y las equinocandinas. El 97% (35/36) de los aislados de A. fumigatus se identificaron correctamente con una Tm de 78,6± 0,1 °C. Por otro lado, el 100% (42/42) de las demás especies estudiadas dentro la sección Fumigati se diferenciaron de A. fumigatus correctamente, mostrando Tm entre 79,1 y 80,5°C. Según los resultados obtenidos en el presente trabajo, podemos inferir que en Argentina circulan al menos desde 1998 especies de la sección Fumigati diferentes de A. fumigatus, en un porcentaje estimado de un 8%. Las especies crípticas detectadas en orden de frecuencia fueron A. udagawae, A. lentulus, A. hiratsukae, A. fumigatiaffinis, A. felis, A. thermomutatus y A. turcosus. Este trabajo constituye el reporte de los primeros casos clínicos en Argentina causados por A. fumigatiaffinis, A. felis y A. thermomutatus, y el primer reporte de A. turcosus en nuestro país. Las pruebas de sensibilidad de las especies crípticas frente a los antifúngicos coincidieron con lo reportado por otros autores. En este estudio se demuestra que los 6 perfiles de CIM para todas las cepas DMic de las especies estudiadas de Argentina, tienen un comportamiento variable similar a lo descripto a nivel mundial, por lo que es necesario la determinación in vitro de cada aislado. Este trabajo contiene descripciones taxonómicas y registros fotográficos de macro y micromorfologia de las especies detectadas en nuestro país. La herramienta qPCRHRM se incorporó a la rutina de laboratorio para la identificación de Aspergillus sección Fumigati, en combinación con la prueba de crecimiento a 50°C, para reducir costos y mejorar los tiempos de identificación. Este trabajo resalta la importancia de realizar estudios multicéntricos para comprender con precisión la epidemiología de las especies de esta sección a nivel nacional o regional.

Aspergillosis is a fungal infection caused by fungi of the genus Aspergillus. Aspergillus fumigatus is the species most frequently associated with human infections. However, Section Fumigati contains at least 59 species, many of which have been reported as agents of aspergillosis and in some cases, may be refractory to antifungal treatment. The aim of this work was to know the species of Aspergillus Section Fumigati different from A. fumigatus circulating in Argentina and to develop a rapid qPCR-HRM method that allows reducing identification times of isolates recovered in culture. For this, all the isolates of A. section Fumigati conserved in the DMic collection between 1984 and 2019 were re- identificated. Their morphological characters and their growth capacity at 50°C were studied. All the isolates that did not grow at that temperature and/or presented 7 aberrant morphology were identified by Multi Locus Sequence Typing (MLST) using the sequences of the ITS (ITS1-5.8S-ITS2), -Tubulin (BenA) and Calmodulin (CaM) genes. Also their in vitro susceptibility profiles against different antifungal agents were analyzed. In addition, specific primers were designed for a 58 bp region of the gene CaM and a total of 93 DNA samples from Aspergillus of 20 different species were tested by qPCRHRM and the melting temperatures (Tm) were studied for the differentiation of the species within the section Fumigati. In total, 356 isolates belonging to 315 patients, sent for identification between 1984 and 2019, were analyzed. These isolates were mostly recovered from sputum (37%), bronchoalveolar lavage (19%), and lung biopsy (15%). Of the 356 isolates, 32 were classified as A. section Fumigati different from A. fumigatus: 13 isolates (7 patients) of A. udagawae, 6 isolates (6 patients) of A. lentulus, 2 isolates (2 patients) of A. fumigatiaffinis, 2 isolates (2 patients) of A. felis, 6 isolates (5 patients and 1 environmental) of A. hiratsukae, 2 isolates (1 patient) of A. thermomutatus and 1 isolate (clinical-environmental) of A. turcosus. The minimum inhibitory concentration (MIC) values obtained with A. felis, A. thermomutatus and A. turcosus against the nine antifungals evaluated were ≤1 mg/L. Something similar happened with A. fumigatiaffinis with the exception of amphotericin B (AB) where MIC values of 2 and 4 mg/L were observed for the isolates of this species. On the contrary, with A. udagawae and A. lentulus higher MIC values were obtained, mainly with AB and triazoles. For A. hiratsukae, MIC values were ≤0.5 mg/L for all antifungals tested except for one strain that showed MIC 1 mg/L for isavuconazole. For A. fumigatus we observed resistance against amphotericin B in 3 strains, while for the rest of the antifungals no resistance was found, the MIC values were ≤1 mg/L. The most active antifungals were itraconazole, voriconazole, and echinocandins. 8 Regarding the qPCR-HRM test, 97% (35/36) of the A. fumigatus isolates were correctly identified with a Tm of 78.6 ± 0.1 °C. On the other hand, 100% (42/42) of the other species studied within the section Fumigati were correctly differenciated from A. fumigatus, showing Tm between 79.1 and 80.5°C. According to the results obtained in this work, we can infer that there are some species of the section Fumigati different from A. fumigatus circulating in Argentina, since 1998, in an estimated percentage of 8%. The cryptic species detected in order of frequency were A. udagawae, A. lentulus, A. hiratsukae, A. fumigatiaffinis, A. felis, A. thermomutatus and A. turcosus. This work constitutes the report of the first clinical cases in Argentina caused by A. fumigatiaffinis, A. felis and A. thermomutatus, and the first report of A. turcosus in our country. The susceptibility tests of the cryptic species against different antifungal agents agreed with those reported by other authors. This study shows that the MIC profiles for all DMic isolates studied in Argentina, have a similar behavior to those described worldwide, so it is necessary to determine in vitro susceptibility of each isolate. This work contains taxonomic descriptions and photographic records of macro and micromorphology of the species detected in our country. The qPCR-HRM tool was incorporated into the laboratory routine for the identification of Aspergillus section Fumigati, in combination with the growth test at 50°C, to reduce costs and improve identification times. This work highlights the importance of conducting multicenter studies to accurately understand the epidemiology of the species in this section at the national or regional level.