Efecto antifúngico de nanopartículas de plata obtenidas a partir de Aspergillus terreus, sobre levaduras del género Cándida

Abstract

La nanotecnología es una ciencia relativamente nueva, que se encuentra en creciente desarrollo debido a su amplia gama de aplicaciones en diferentes áreas. En las últimas décadas, la nanotecnología se ha centrado en el estudio e investigación de las nanopartículas metálicas, principalmente las nanopartículas de plata (AgNPS). La biosíntesis de las mismas, ha recibido gran atención debido a su extensa variedad de aplicaciones médicas, entre la que se destaca su potencial efecto antimicrobiano. Últimamente se observó un aumento de microorganismos resistentes a los antimicrobianos de uso convencional. Así también, las infecciones fúngicas oportunistas se incrementaron dramáticamente. Aunque, los principales agentes causales siguen siendo Candida y Aspergillus, el espectro de patógenos fúngicos ha cambiado y se han diversificado. Los azoles y polienos han sido el pilar fundamental en la terapia antimicótica durante años, sin embargo, la resistencia a fluconazol manifestada por diferentes cepas patógenas, y la elevada toxicidad de la anfotericina B, impulsaron investigaciones de nuevas moléculas con potencial antifúngico. En el presente estudio, se biosintetizaron AgNPS empleando, como agente reductor de los iones Ag+ , los metabolitos presentes en el sobrenadante de un cultivo de Aspergillus terreus. La biorreducción de las AgNPS obtenidas se monitorearon por espectroscopía ultravioleta-visible,mostrando una absorbancia máxima a 440 nm. También se caracterizaron por microscopía electrónica de barrido, detectando un tamaño promedio de 55 nm y caracteres morfológicos de nanopartículas esféricas. Finalmente, los estudios de espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier permitieron corroborar la presencia de proteínas como agentes estabilizadores que rodean las AgNPS. El potencial antifúngico de las AgNPS se evaluó por el método de difusión en agar (con modificaciones) y el método de microdilución en caldo (con modficaciones). Las cepas ensayadas correspondieron a aislamientos clínicos y cepas ATCC. Las cepas evaluadas mediante el método de difusión en agar fueron: Candida albicans, Candida glabrata, y Candida tropicalis, (una de cada una) y dos cepas ATCC : Candida parapsilosis ATCC 22019 y Candida krusei ATCC 6258. Los halos de inhibición obtenidos fueron 15 mm en el caso de C. albicans; 13 mm en C.parapsilosis ; 17 mm en C. krusei. En C. glabrata y C.tropicalis no se registraron halos de inhibición. En cuanto al método de microdilución en caldo, se ejecutó siguiendo los lineamientos del European Committee on Antimirobial Susceptibility Testing (EUCAST) en su documento EDEF 7.3.1 con modificaciones. Las cepas ensayadas fueron: 3 cepas de C. albicans, 3 cepas de C. glabrata, 3 cepas de C. parapsilosis, 3 cepas de C. tropicalis y 3 cepas de C. krusei. También se ensayaron 1 cepa C. krusei ATCC 6258 y C. parapsilosis ATCC 22019. Los resultados de concentración inhibitoria mínima (CIM) obtenidos fueron de 64 µg/mL de AgNPS en todas las cepas ensayadas de C. albicans. C. glabrata, C.parapsilosis, C. tropicalis y para la C.parapsilosis ATCC 22019, mientras que la CIM obtenida frente a C. krusei fue (aislamientos clínicos y ATCC ) de 32 µg/mL En el presente estudio también se realizaron estudios de citotoxicidad en donde las AgNPS mostraron un efecto citotóxico dependiente de la dosis en células hepáticas normales.

Nanotechnology is a relatively new science, which is in increasing development due to its wide range of applications in different areas. In recent decades, nanotechnology has focused on the study and research of metallic nanoparticles, mainly silver nanoparticles (AgNPS). Their biosynthesis has received great attention due to its wide variety of medical applications, among which its potential antimicrobial effect stands out. Lately, an increase in microorganisms resistant to antimicrobials in conventional use has been observed. Likewise, opportunistic fungal infections increased dramatically. Although the main causative agents continue to be Candida and Aspergillus, the spectrum of fungal pathogens has changed and diversified. Azoles and polyenes have been the mainstay in antifungal therapy for years, however, the resistance to fluconazole manifested by different pathogenic strains, and the high toxicity of amphotericin B, prompted investigations of new molecules with antifungal potential. In the present study, AgNPS were biosynthesized using, as a reducing agent for Ag+ ions, the metabolites present in the supernatant of a culture of Aspergillus terreus. The bioreduction of the AgNPS obtained was monitored by ultraviolet-visible spectroscopy showing a maximum absorbance at 440 nm. They were also characterized by scanning electron microscopy, detecting an average size of 55 nm and morphological characters of spherical nanoparticles. Finally, Fourier transform infrared spectroscopy studies allowed us to corroborate the presence of proteins as stabilizing agents that surround the AgNPS. The antifungal potential of AgNPS was evaluated by the agar diffusion method (with modifications) and the broth microdilution method (with modifications). The tested strains corresponded to clinical isolates and ATCC strains. The strains tested by the agar diffusion method were: Candida albicans, Candida glabrata, and Candida tropicalis, (one of each) and two ATCC strains: Candida parapsilosis ATCC 22019 and Candida krusei ATCC 6258. The inhibition halos obtained were 15 mm in the case of C. albicans; 13 mm in C.parapsilosis ; 17 mm in C. krusei. In C. glabrata and C. tropicalis, no inhibition halos were recorded. Regarding the broth microdilution method, it was carried out following the guidelines of the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) in its document EDEF 7.3.1 with modifications. The tested strains were: 3 strains of C. albicans, 3 strains of C. glabrata, 3 strains of C. parapsilosis, 3 strains of C. tropicalis and 3 strains of C. krusei. 1 strain C. krusei ATCC 6258 and C. parapsilosis ATCC 22019 were also tested. The minimum inhibitory concentration (MIC) results obtained were 64 µg/mL of AgNPS in all C. albicans strains tested. C. glabrata, C.parapsilosis, C. tropicalis and for C.parapsilosis ATCC 22019, while the MIC obtained against C. krusei was 32 µg/mL (clinical isolates and ATCC). Cytotoxicity studies were also performed in the present study where AgNPS showed a dose-dependent cytotoxic effect on normal liver cells