Evaluación de dos métodos para la determinación de la sensibilidad in vitro del complejo Aspergillus terreus frente a antifúngicos

Abstract

Aspergillus terreus comprende un complejo de hongos filamentosos pertenecientes a la familia Aspergillaceae, subgénero Circumdati, sección Terrei. En los últimos años se ha observado un aumento significativo de aislamientos de A. terreus complex, respecto de otras especies del mismo Género, ocasionando infecciones superficiales y profundas localizadas. Dichas infecciones suelen ser de difícil resolución, de pronóstico reservado a grave, en parte por las dificultades en el diagnóstico temprano e identificación correcta del microorganismo y además por la presencia de aislados menos sensibles a los antifúngicos y, en general, resistentes in vitro e in vivo a la AMB. Los métodos de referencia M38-A2 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) y el E.DEF 9.3 del European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) permiten determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) frente a los hongos filamentosos de manera fiable, reproducible y resultan muy útiles para la vigilancia epidemiológica. Pero la realización de dichas técnicas es engorrosa, muy laboriosa y costosa, motivos por los que su aplicación en los laboratorios es limitada. El documento M51-A del CLSI describe un método de difusión en agar para hongos miceliales con resultados cualitativos hasta 24 h antes de los resultados que se obtienen con la determinación de la CIM. La técnica de difusión en agar usando tabletas cargadas con antifúngicos (Neo-SensitabsTM) resulta un recurso atractivo debido a su simplicidad, bajo costo y disponibilidad en el país. Pero hay pocos estudios realizados en Aspergillus spp. Los objetivos del trabajo fueron correlacionar el método de difusión en agar con tabletas Neo-SensitabsTM y el método de referencia de microdilución en caldo, M38-A2 del CLSI, para los aislados del complejo A. terreus; valorar su aplicabilidad en la rutina del laboratorio y evaluar si el método de difusión en agar es eficaz para detectar aislados resistentes a los antifúngicos estudiados. Para ello se trabajó con 28 aislados ambientales y 24 clínicos del complejo A. terreus que se encontraban almacenados en la colección de cultivos del Área de Micología del Instituto de Medicina Regional de la Universidad Nacional del Nordeste. Por un lado, se llevó a cabo el método de dilución en caldo según el método de referencia, M38-A2 del CLSI. Se ensayó la actividad in vitro del voriconazol (VRC), el itraconazol (ITC), la terbinafina (TRB) y AMB frente a estos aislados. Para el análisis se utilizaron los puntos de corte propuestos en dicho documento. Por otro lado, se realizó el método de difusión en agar. La determinación de la sensibilidad se efectuó según el documento M51-A del CLSI y se eligieron las tabletas Neo-SensitabsTM Rosco como reservorios de los antifúngicos a evaluar. Se utilizaron tabletas de 9 mm de diámetro, cargadas con: 10 μg de ITC, 1 μg de VRC, 10 μg de AMB y 30 μg de TRB. La lectura fue visual a las 24 y 48 h de incubación y los halos de inhibición se midieron con regla milimetrada. La interpretación de los resultados se realizó de acuerdo a las indicaciones del fabricante, que utiliza los puntos de corte del CLSI. Para conocer el grado de asociación entre el método de referencia y el método de difusión, se determinaron los coeficientes de correlación de Pearson para cada antifúngico y, en caso de ser posible, se realizaron los análisis de regresión lineal. Para los métodos estudiados se observaron distintas categorías de discrepancias. Para cada antifúngico, excepto TRB, se calculó el porcentaje de concordancia entre ambos métodos. Se calculó la media geométrica, moda, rango, CIM50 y CIM90. La AMB mostró los valores más elevados de CIM frente a todos los aislados de A. terreus estudiados y la mayoría de los aislados fueron categorizados dentro de las categorías de resistentes y con sensibilidad intermedia. Además presentó los halos de inhibición más chicos por el método de difusión, donde la mayoría de los aislados fueron categorizados como resistentes. El VRC y el ITC presentaron valores bajos de CIM en el 100% de los aislados y todos fueron categorizados como sensibles, al igual que por el método de difusión. Para la TRB, todos los aislados tuvieron valores bajos de CIM por el método de referencia y todos presentaron halos de inhibición mucho más amplios que 17 mm por el método de difusión. El modelo de correlación lineal no pudo ser utilizado para explicar la variable halo de inhibición en función de la CIM cuando se compararon ambos métodos para la AMB, el VRC, el ITC y la TRB frente a aislados de A. terreus complex. El método de difusión presentó 100% de concordancia con el método de referencia para los azoles, sin ninguna discrepancia. Las discrepancias y la baja concordancia se presentaron al analizar la AMB. El método por difusión en agar con tabletas Neo-SensitabsTM es una técnica de bajo costo, rápida y simple, fácilmente aplicable a la rutina de los laboratorios clínicos para determinar la sensibilidad de aislados del complejo A. terreus frente al VRC y al ITC. Sin embargo, se propone que la AMB sólo sea estudiada mediante el MR para los aislados de este complejo, con el fin de conocer la epidemiología de la resistencia a dicha droga en cada región geográfica.