Efecto del tiempo de preservación empleando el método de Castellani y la crioconservación sobre la actividad enzimática en Candida albicans

Abstract

Debido al incremento en la incidencia de las infecciones causadas por levaduras del género Candida, hay un gran interés en la investigación de sus factores de virulencia con la finalidad de establecer una relación entre estos factores y la patogenicidad, diseñar estrategias de control y prevención de las candidiasis, así como desarrollar nuevos agentes terapéuticos con estos factores como posibles blancos de acción. A pesar de que existen numerosas publicaciones en las cuales se examina la producción de enzimas hidrolíticas en aislados de C. albicans y su papel en la patogénesis de las candidiasis, la preservación de la secreción enzimática a lo largo del tiempo de conservación aún no ha sido exhaustivamente estudiada. La conservación de cepas de Candida es indispensable en un laboratorio de Micología debido a que son consideradas material necesario para enseñanza, investigación y como testigos para estudios especiales. Un método muy utilizado y que aporta altos porcentajes de viabilidad, es la suspensión en agua destilada estéril. El objetivo general de este trabajo fue evaluar el efecto del tiempo de preservación empleando los métodos de Castellani y congelación sobre la actividad esterasa, fosfolipasa y proteinasa de Candida albicans. Se utilizaron 30 cepas aisladas a partir de muestras clínicas provenientes de pacientes tanto intra como extra hospitalarios del Hospital del Carmen de Mendoza. El aislamiento de cada cepa, se realizó en agar glucosado Sabouraud y en medio CHROMagarTM Candida. El estudio micromorfológico se realizó en el medio agar harina de maíz y la identificación definitiva se realizó por espectrometría de masas por sistema MALDI-TOF. Todas las cepas fueron conservadas según los métodos de Castellani y congelación durante 0, 2, 4, 6 y 12 meses. Luego de transcurrido cada uno de esos tiempos, se registró la viabilidad y midió la actividad enzimática. Para determinar la producción de proteinasas, fosfolipasas y esterásicas se utilizaron los medios albúmina sérica bovina, Sabouraud yema de huevo y el test de opacidad del Tween 80, respectivamente. Las lecturas de cada actividad se realizaron a las 24, 48 y 72 horas de incubación midiendo el diámetro de la colonia y el diámetro de la colonia más el halo o la zona de hidrólisis. A partir de la relación entre estos valores se calcularon los índices Pz. Al evaluar el porcentaje de supervivencia de las cepas de C. albicans conservadas durante un año con el método de congelación, se pudo comprobar la eficacia de este método, ya que, de las 30 cepas evaluadas se recuperó el 100% al año de conservación. Mientras que, con el método de Castellani, la viabilidad que se obtuvo fue del 66,67%. Los resultados obtenidos en esta tesis conforman las primeras estimaciones sobre el efecto del tiempo de conservación empleando los métodos de Castellani y el de congelación sobre la actividad enzimática en cepas de C. albicans y demostraron que la evolución de las tres actividades enzimáticas a lo largo de todo el ensayo, fue diferente. Mientras que la actividad esterásica mostró menor actividad enzimática que se mantuvo constante durante los 12 meses, la actividad fosfolipasa en la primera medición temporal, presentó mayor actividad enzimática que disminuyó con el transcurrir del tiempo. En tanto que, la actividad proteolítica tuvo un comportamiento opuesto a la fosfolipasa, incrementando su actividad al final del ensayo. No se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas entre ambos métodos de conservación. Es importante continuar con los estudios que evalúen actividades enzimáticas (proteasas, fosfolipasas, esterasas, hemolisinas y coagulasas) así como otros factores de virulencia, como son: adherencia, cambio fenotípico, morfología celular y producción de biopelículas en cepas de C. albicans y en otros microorganismos, para determinar su estabilidad a lo largo del tiempo de conservación por distintos métodos e identificar hasta qué momento se pueden preservar las cepas aisladas para garantizar la reproducibilidad de las investigaciones.