Evaluación de la actividad antiinflamatoria in vitro de extractos de Cannabis sativa L. y de látex de Croton urucurana por medio de PCR cuantitativa (qPCR)

Abstract

La inflamación es un mecanismo de defensa y representa la activación inicial del sistema inmune. Bajo ciertas condiciones, el organismo no es capaz de ejercer una regulación apropiada, haciendo necesario el uso de fármacos, siendo los antiinflamatorios no esteroides uno de los grupos de medicamentos más prescritos a nivel mundial a pesar de sus frecuentes efectos adversos. En este contexto, el extendido uso de plantas medicinales como alternativa terapéutica, especialmente en América Latina y el Caribe, en adición a la evidencia científica escasa sobre su eficacia y seguridad, promueven la realización de estudios que permitan evaluar la actividad de los productos vegetales, identificar principios activos con potencial terapéutico y escasos efectos adversos, y determinar la seguridad de los derivados utilizados. Cannabis sativa L. y Croton urucurana son especies con un amplio potencial terapéutico e intenso uso en medicina tradicional. Cannabis sativa L. es una planta con gran capacidad de adaptación a diversas condiciones ambientales, cuyos metabolitos más abundantes son los cannabinoides, concentrados principalmente en sus inflorescencias femeninas. Su potencial terapéutico ha sido ampliamente evaluado y reconocido en situaciones determinadas. El CBD es el cannabinoide más relevante desde el punto de vista farmacéutico; ha demostrado actividad antioxidante, antiinflamatoria, antimicrobiana, neuroprotectora, ansiolítica y anticonvulsivante. En cuanto al género Croton, comprende numerosas especies de distribución pantropical sobre las que se reportan numerosos usos en la medicina tradicional. En nuestra región, la especie representante es Croton urucurana, cuyo látex ha sido utilizado por sus efectos antiinflamatorios y analgésicos, así como para la cicatrización y el tratamiento de heridas infectadas. Si bien existen numerosos modelos in vivo e in vitro para la evaluación de la actividad antiinflamatoria de plantas, las técnicas de cultivo celular han dado resultado en diversas investigaciones, destacándose el uso de la línea de macrófagos murinos RAW 264.7 para este fin. Considerando esto, el objetivo de este trabajo fue determinar la actividad antiinflamatoria de un extracto etanólico de Cannabis sativa, y de látex de Croton urucurana a través de PCR cuantitativa (qPCR), mediante la evaluación de su influencia en la expresión de las citoquinas proinflamatorias IL1β, IL6 y TNFα por la línea celular RAW 264.7 expuesta a un estímulo proinflamatorio de lipopolisacárido bacteriano (LPS). El extracto de Cannabis sativa se obtuvo por molienda del material vegetal, macerado en etanol 96° a temperatura ambiente durante 15 días al abrigo de la luz y posterior filtrado y secado en rotavapor a presión reducida. El látex de Croton urucurana se obtuvo por incisiones en la corteza de ejemplares adultos y recolección del exudado, filtrado y secado en rotavapor a presión reducida. Se determinaron las concentraciones tóxicas de ambos productos sobre la línea RAW 264.7 mediante un ensayo de XTT con el que se evaluó la viabilidad de las células expuestas a diferentes concentraciones de estos. Se obtuvieron reducciones no significativas de la viabilidad con Cannabis[100 μg/ml] y con Croton [10 μg/ml], por lo que estas fueron las máximas concentraciones que se aplicaron para estimular la línea en los ensayos posteriores. El efecto antiinflamatorio de ambos productos se evaluó mediante qPCR, para lo cual se preincubaron durante una hora las células RAW 264.7 con látex de Croton a concentraciones de 10 μg/ml y 1 μg/ml y con extracto de Cannabisa concentraciones de 100 μg/ml y 10 μg/ml. Transcurrido este tiempo, se estimularon con LPS y se incubaron durante 8 horas. Las células fueron lisadas con el reactivo TRI-Reagent® (Sigma Aldrich), se extrajo el ARN obtenido y se cuantificó por su absorbancia a 260 nm. Se retrotranscribió el total del ARNm a ADN copia (ADNc) usando oligoDT como primer de reacción. Los ADNc obtenidos fueron evaluados por qPCR, a partir de la amplificación de los fragmentos correspondientes a las citoquinas proinflamatorias seleccionadas y del gen de referencia GAPDH. Se tomaron los CT obtenidos de la reacción a partir del programa Eco Study Version 5.0, se calcularon los parámetros ΔCT y 2^- ΔΔCT para el total de amplificaciones y se analizaron estadísticamente mediante GraphPad Prism 8.3.0, aplicando la prueba t de student (α= 0,05) comparando cada protocolo de tratamiento respecto a la estimulación con LPS sin preincubación. El tratamiento de la línea con extracto de Cannabisa una concentración de 100 μg/ml generó una diferencia significativa en la expresión de IL1β (*, p<0,05) e IL6 (*, p<0,05), resultando no significativo (ns) para TNFα. No se obtuvieron diferencias significativas al preincubar con extracto de Cannabisa 10 μg/ml: IL1β (ns), IL6 (ns), TNFα (ns). En cuanto al tratamiento con látex de Croton urucurana, la preincubación a 10 μg/ml no dio lugar a diferencias significativas: IL1β (ns), IL6 (ns), TNFα (ns). La preincubación a 1 μg/ml evidenció, de forma inesperada, una diferencia significativa del tipo proinflamatoria respecto al grupo LPS en la expresión de IL1β (*, p<0,05); las diferencias respecto a IL6 y TNFα resultaron no significativas. En conclusión, el extracto etanólico de Cannabis sativa presentó actividad antiinflamatoria en el modelo de células RAW 264.7 estimuladas con LPS, evidenciada por la disminución de la expresión de IL-1β e IL-6 y es dosis dependiente. El látex de Croton urucurana no presentó actividad antiinflamatoria en el modelo de estudio.