Identificación y perfil de expresión genético de nuevos genes involucrados en el desarrollo de mesodermo anterior y en el carcinoma renal de células claras (ccRCC)

Abstract

Existen similitudes y paralelismos compartidos entre la embriogénesis y la oncogénesis que involucran varios eventos moleculares y morfológicos. Teniendo presente esto, esta tesis propone como objetivo general describir la expresión de genes noveles y de miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante (TGF-β) en la formación del eje anteroposterior y el modelado del mesodermo en las células madre embrionarias (ES) murinas y evaluar su posible implicancia en el desarrollo del carcinoma renal de células claras (ccRCC). En una primera instancia se identificaron y analizaron quince potenciales genes candidatos que poseen un rol en el desarrollo del mesodermo murino mediante un sistema que combina el uso de cultivos 3D (mEB) con el análisis de una serie de reacciones en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (RT-qPCR). Sólo de once de estos genes se evaluó su patrón de expresión génica, posterior a la adición de moléculas estimulantes o inhibidoras con un papel relevante durante el desarrollo murino: Activina A, proteína morfogénica ósea 4 (BMP4) y el inhibidor de Activina A conocido como SB431542. A su vez, los patrones de expresión analizados se compararon con los de genes de referencia del desarrollo embrionario murino (Nanog, Oct4, Nodal, T, Snail1, N-cad, Evx1, E-cad, Sox17 y Sox1). Es así que, el análisis de los datos permitió reconocer que cinco del total de genes candidatos (Ccpg1os, D230030E09Rik, Dmgdh, Mlf1 y Pcdh19), son sensibles a la acción de los factores de crecimiento pertenecientes a la superfamilia del TGF-β y que también se encuentran potencialmente involucrados en la inducción/diseño del mesodermo murino. La vía del TGF-β tiene un rol importante tanto en la embriogénesis como en la tumorigénesis y comprende a las BMPs. Dentro de esta subfamilia, la isoforma 7 de la proteína morfogenética ósea (BMP7), tiene un importante papel en la fisiología y fisiopatología del riñón pre y postnatal. Adicionalmente, se expresa en muchos tipos de carcinomas e incluso es predominante en los carcinomas de células renales (CCR) en comparación con el tejido normal. La familia de las BMPs, cómo se mencionó previamente, es un factor común existente entre la embriogénesis y la oncogénesis, pero no es el único. En esta tesis se pone foco en otro elemento compartido por ambos procesos, la hipoxia. Este estado de ausencia de oxigeno, se sabe que desencadena mecanismos adaptativos de supervivencia celular tanto en estados fisiológicos como fisiopatológicos y es por ello que se procede con su estudio. Es así que, en la segunda parte de los resultados de esta tesis y mediante estudios multiparamétricos (cultivos 3D, RT-qPCR, IHQ e ICT) se describe por primera vez en forma global a nuestro entender la localización de BMP7 y HIF-2α (factor de transcripción clave de hipoxia) en muestras de core y periferia de ccRCC de acuerdo a los estadíos patológicos del tumor (Clasificación TNM: I, II y III). De la misma manera se procede con E-CAD (indicativa de TEM) y Ki-67 (marcador de proliferación). Por otra parte, se pudo evidenciar una expresión de HIF-2α casi 5 veces mayor a la de HIF-1α, en muestras de ccRCC la cual fue significativamente mayor en el núcleo respecto a la periferia en todos los grupos experimentales. La determinación de los índices de proliferación (IP) de Ki-67 fueron estadísticamente más altos en el core en comparación con la periferia tumoral en todos los estadíos estudiados. Asimismo, al evaluar la expresión de E-CAD en las muestras de ccRCC se comprobó que era de tipo diferencial en las distintas zonas del tumor, siendo mayor en la periferia en comparación con el centro de las mismas. El análisis de correlación entre BMP7con Ki67 y HIF-2α, respectivamente, evidenció su asociación con una elevada proliferación celular e hipoxia en la región del core, proporcional con el aumento de la estadificación tumoral. A su vez, la correlación negativa existente entre BMP7 y E-CAD en la

periferia del tumor es indicativa de la disminución del progreso de la transición epitelial- mesenquimal (TEM).

Así, en la primera parte del desarrollo de esta tesis se han identificado cinco nuevos genes sensibles a miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante (TGF-β) en las células madre embrionarias (ES) murinas para la formación del eje anteroposterior y el modelado del

mesodermo. Y, en la segunda parte se describieron por primera vez las expresiones de BMP-7, Ki- 67, HIF-2α y E-CAD en diferentes zonas de muestras tumorales de ccRCC. En conjunto, este estudio

establece nuevas relaciones moleculares entre los eventos embriológicos y oncológicos. Para finalizar, las conclusiones derivadas de estas tesis podrían aplicarse con el fin de utilizar la determinación conjunta de Ki67, BMP7 y E-CAD en diferentes zonas del tumor como potenciales biomarcadores diagnósticos y/o pronósticos para los ccRCC.

There are similarities and shared parallels between embryogenesis and oncogénesis involving several molecular and morphological events. With this in mind, the overall aim of this thesis is to describe the expression of novel genes and members of the transforming growth factor-β superfamily (TGF-β) in the formation of the anteroposterior axis and mesoderm patterning in murine embryonic stem (ES) cells and to assess their possible implication in the development of clear cell renal cell carcinoma (ccRCC). Fifteen potential candidate genes that play a role in murine mesoderm development were first identified and analysed using a system that combines the use of 3D culture (mEB) with the analysis of a series of quantitative real-time polymerase chain reactions (RT-qPCR). Only eleven of these genes were evaluated for their gene expression pattern, following the addition of stimulatory or inhibitory molecules with a relevant role during murine development: Activin A, bone morphogenic protein 4 (BMP4) and the Activin A inhibitor known as SB431542. In turn, the expression patterns analysed were compared with those of reference genes in murine embryonic development (Nanog, Oct4, Nodal, Bra, Snail1, N-cad, Evx1, E-cad, Sox17 and Sox1). Thus, data analysis allowed us to recognise that five of the total candidate genes (Ccpg1os, D230030E09Rik, Dmgdh, Mlf1 and Pcdh19) are sensitive to the action of growth factors belonging to the TGF-β superfamily and are also potentially involved in the induction/design of murine mesoderm. TGF-β pathway has an important role in both embryogenesis and tumorigenesis and comprises the BMPs. Within this subfamily, bone morphogenetic protein isoform 7 (BMP7) plays an important role in pre- and postnatal kidney physiology and pathophysiology. Additionally, it is expressed in many types of carcinomas and is even predominant in renal cell carcinomas (RCC) compared to normal tissue. The family of BMPs, as previously mentioned, is a common factor existing between embryogenesis and oncogenesis, but it is not the only one. This thesis focuses on another element shared by both processes, hypoxia. This state of absence of oxygen is known to trigger adaptive mechanisms of cell survival in both physiological and pathophysiological states and that is why we proceed with its study. Thus, in the second part of the results of this thesis and by means of multi-parametric studies (3D culture, RT-qPCR, IHQ and ICT) the localisation of BMP7, HIF-2α (hypoxia key transcription factor), E-CAD (indicative of EMT) and Ki-67 (proliferation marker) in core and peripheral samples of ccRCC according to the pathological stages of the tumour (TNM classification: I, II and III) is described for the first time in a global way to our knowledge. On the other hand, HIF-2α expression was almost 5 times higher than HIF-1α expression in ccRCC samples and was significantly higher in the core than in the periphery in all experimental groups. Likewise, E-CAD expression in the ccRCC samples was found to be differentially expressed in the different areas of the tumour, being higher in the periphery compared to the centre of the tumour. Correlation analysis of BMP7 with Ki67 and HIF-2α, respectively, showed their association with elevated cell proliferation and hypoxia in the core region, proportional to increased tumour staging. In turn, the negative correlation between BMP7 and E-CAD in the tumour periphery is indicative of decreased epithelial-mesenchymal transition (EMT) progression. Thus, in the first part of the development of this thesis, five new genes sensitive to members of the transforming growth factor-β superfamily (TGF-β) have been identified in murine embryonic stem (ES) cells in the formation of the anteroposterior axis and the modelling of the mesoderm. And, in the second part, the expressions of BMP7, Ki-67, HIF-2α and E-CAD in different areas of ccRCC tumour samples were described for the first time. Taken together, this study establishes new molecular relationships between embryological and oncological events. Finally, the conclusions derived from these theses could be applied to use the joint determination of Ki67, BMP7 and E-CAD in different tumour sites as potential diagnostic and/or prognostic biomarkers for ccRCC.