Embriología, niveles de ploidía y fertilidad en especies de la subtribu Lepidaploinae (Vernonieae, Asteraceae)

Abstract

La subtribu Lepidaploinae es un grupo monofilético que comprende alrededor de 320 especies, agrupados en trece géneros, que crecen principalmente en América del Sur y algunas pocas entidades que viven en la India Occidental. Las especies de los géneros Lessingianthus, Chrysolaena y Lepidaploa poseen una estrecha relación filogenética y presentan especies morfológicamente similares que dificultan su delimitación taxonómica. Se han realizado numerosos estudios morfológicos, palinológicos y citogenéticos en las especies de los tres géneros en busca de caracteres diagnósticos que contribuyan a esclarecer los problemas taxonómicos. Sin embargo, aún no se han hecho aportes desde la embriología y la morfoanatomía floral. El objetivo principal de este trabajo fue contribuir al conocimiento de la biología reproductiva de las especies de Lessingianthus, Chrysloaena y Lepidaploa con resultados que brinden caracteres diagnóstico a la taxonomía de la subtribu y mejoren la interpretación de las relaciones filogenéticas. Por tal motivo, se estudiaron áreas aún no analizadas o de información fragmentada como la fertilidad masculina (configuración y comportamiento meiótico, producción de esporadas), la viabilidad del polen, el desarrollo del gametofito masculino y femenino, la morfoanatomía floral y del nectario. El análisis del número cromosómico confirmó los números básicos de los géneros Lessingianthus (n=16), Chrysolaena (n=10) y Lepidaploa (n=14). Se reportaron recuentos de nuevas localidades de poblaciones del Chaco y Formosa de Ls. rubricaulis, y poblaciones de C. cognata, C. flexuosa y C. lithospermifolia de localidades de Corrientes y Formosa. Respecto al nivel de ploidía, se identificaron diploides y la mayoría de las entidades resultaron poliploides con diferentes y elevados niveles de ploidía: en Lessingianthus se reportaron citotipos diploides (2n=2x=32), tetraploides (2n=4x=64), hexaploide (2n=6x=96), octoploide (2n=8x=128) y decaploide (2n=10x=160); en Chrysolaena se reportaron citotipos diploides (2n=2x=20), tetraploides (2n=4x=40) y hexaploides (2n=6x=60). El estudio de las configuraciones meióticas reveló cinco tipos diferentes de configuraciones que incluyen la formación de univalentes (I), bivalentes (II) y tetravalentes (IV). La preponderancia de configuraciones bivalentes en comparación a la escasa proporción de multivalentes observados, indica que en los taxones analizados ocurrieron rearreglos cromosómicos tendientes a estabilizar la meiosis de los mismos y por lo tanto poseen una elevada estabilidad meiótica; en el caso particular del taxón L. plantaginoides (4x), pudimos inferir su naturaleza autotetraploide y confirmar que es una entidad altamente diploidizada. El análisis de la fertilidad masculina permitió determinar que tanto las especies diploides como las especies poliploides presentaron comportamiento meiótico regular superior al 70%, un porcentaje alto de formación de tétradas y elevados porcentajes de polen viable. La meiosis I resultó ser la fase más inestable, especialmente anafase I que presentó mayor variabilidad de aberraciones meióticas y los principales mecanismos de formación de gametos no reducidos fueron: cromosomas fuera de placa, puentes sin fragmento, asincronía en la meiosis I y II. Los resultados permitieron descartar la hipótesis de que las entidades poliploides tendrían elevada inestabilidad meiótica y por lo tanto, baja fertilidad. Inferimos que las entidades analizadas son taxones paleopoliploides y confirmamos que los genomas de las especies analizadas experimentaron rearreglos cromosómicos que restablecieron su fertilidad. Los resultados del estudio del desarrollo del gametofito masculino y femenino son novedosos para la subtribu, contribuyen al conocimiento de la biología reproductiva de las especies, y pueden ser utilizados con finalidades taxonómicas y evolutivas. El desarrollo del gametofito masculino y de la pared de la antera no varía considerablemente entre los diferentes géneros o especies; los siguientes caracteres del androceo son conservados y comunes a las especies analizadas de los tres géneros: anteras tetraesporangiadas, pared de la antera conformada por cuatro capas (endotecio, capa media, epidermis y tapete) de desarrollo tipo dicotiledóneo, epidermis persistente y tapete invasivo no sincitial, tétradas de disposición tetragonal y tetraédrica, y granos de polen liberados en estadío tricelular. Otros caracteres como la disposición de las células esporógenas primarias en hilera vertical dentro de la antera y el desarrollo del tapete, son características que requieren un estudio más amplio y exhaustivo entre los demás géneros de la tribu. El desarrollo del gametofito femenino presenta caracteres uniformes (como la formación de una tétrada linear de megásporas, la presencia de sacos embrionarios monospóricos, megáspora chalazal funcional y desarrollo tipo Polygonum) y caracteres variables (espesor e inicio de la diferenciación del tapete integumentario, el comportamiento de las antípodas y las sinérgidas) que pueden ser de utilidad taxonómica. Se observaron sacos embrionarios asexuales maduros en baja proporción en dos especies diploides pertenecientes a los géneros Lessingianthus y Lepidaploa. A pesar de ello, todas las especies (diploides y poliploides) estudiadas en este trabajo formaron gametofitos reducidos sexuales por lo tanto inferimos que se reproducen sexualmente. Este estudio constituye el primer aporte a la embriología de los géneros sudamericanos de la tribu Vernonieae, y al mismo tiempo, es la primera vez que se analiza el tipo de reproducción en relación al nivel de ploidía. Los caracteres analizados de la morfoanatomía floral presentaron diferentes grados de variación y de utilidad taxonómica; se identificaron caracteres útiles a nivel específico y que colaboran en la identificación de especies morfológicamente similares (forma el apéndice apical de la antera y presencia de tricomas glandulares en el estilo y anteras); caracteres de dudosa utilidad taxonómica, por presentar variabilidad intrapoblacional (número de costillas del ovario, forma de los cristales de oxalato de calcio, nódulo estilar basal, idioblastos de la pared del ovario y tricomas glandulares del ovario) y nuevos caracteres variables poco estudiados que pueden ser de utilidad taxonómica (presencia/ausencia de canales del mesófilo de la corola, forma de la epidermis externa e interna de la corola, grosor de la cutícula de la corola y composición de la pared del ovario). Estos caracteres brindan nuevas perspectivas de análisis para las especies de la tribu Vernonieae, razón por lo cual pueden ser de gran utilidad taxonómica entre los géneros. Por otra parte, el análisis estadístico realizado fue útil para separar a las especies de los géneros Lessingianthus y Chrysolaena, mientras que las especies del género Lepidaploa presentaron caracteres intermedios entre los géneros Chrysolaena y Lepidaploa. Si bien los tres géneros comparten similitud morfológica y anatómica, en el presente capítulo se proporcionan nuevas perspectivas de análisis, y por lo tanto nuevas oportunidades en la búsqueda de sinapomorfías que sustenten la división de los géneros bajo estudio. El estudio de la morfoanatomía de los nectarios es el primero realizado en las especies de los géneros estudiados. Todas las especies estudiadas presentaron un nectario tipo “gynoecialia” ubicado en la porción superior del ovario y adosado a la porción inferior del estilo, de forma anular con nectarostomas dispersos. Los nectarios son conservados respecto de la anatomía (como las características del tejido epidérmico, el parénquima secretor subyacente y el tejido vascular), la ubicación topográfica y morfología general. Ciertos caracteres morfológicos variaron en cuanto a: tamaño (alto y ancho) y forma del borde superior del nectario; tipo, densidad y distribución de los nectarostomas, ancho estomático y pubescencia. La diversidad observada permitió clasificar los nectarios en cuatro morfotipos diferentes: Tipo I, Tipo II, Subtipo IIa y Tipo III. Esta clasificación es sustentada por el análisis estadístico realizado en base a caracteres cualitativos y cuantitativos. Los caracteres variables son útiles desde el punto de vista taxonómico para discriminar entre especies morfológicamente similares y pueden ser útiles para entender las relaciones entre los géneros de la tribu Vernonieae, sin descuidar otras características importantes como la biología reproductiva y el contexto ecológico en el que se desarrollan los nectarios. A través de los resultados obtenidos se contribuyó al conocimiento de la biología reproductiva de las especies de los géneros Lessingianthus, Chrysolaena y Lepidaploa. Mediante los estudios citogenéticos inferimos la naturaleza de las especies (auto o alotetraploide), la edad de los poliploides (neo o paleopoliploide), la fertilidad masculina y esclarecimos los mecanismos citológicos involucrados en la formación de gametas no reducidas. Los estudios embriológicos han introducido nuevos caracteres de utilidad taxonómica y han esclarecido el modo de reproducción de los poliploides. El análisis de la morfoanatomía floral y diversidad de los nectarios ha brindado una fuente valiosa de datos útiles que colaboran a la circunscripción de los tres géneros y plantean nuevas perspectivas de estudio en la Tribu Vernonieae. Dado que la fertilidad de las especies estudiadas es elevada (tanto los diploides como los poliploides poseen altos porcentajes de regularidad meiótica), producen tétradas normales y granos de polen viables, a la vez que forman sacos embrionarios de origen sexual, rechazamos la hipótesis inicial de que los poliploides tendrían elevados porcentajes de irregularidad meiótica, baja fertilidad, y formarían principalmente sacos asexuales de naturaleza apomíctica. Finalmente, por todo lo antes expuesto, confirmamos que las especies con elevados niveles de ploidía son poliploides altamente diploidizados y de reproducción sexual.

The subtribe Lepidaploinae is a monophyletic group comprising about 320 species, grouped in thirteen genera, growing mainly in South America and some few entities living in Western India. Species of the genera Lessingianthus, Chrysolaena and Lepidaploa have a close phylogenetic relationship and present morphologically similar species that difficult their taxonomic delimitation. Numerous morphological, palynological and cytogenetic studies have been carried out on the species of the three genera in search of diagnostic characters to help clarify taxonomic problems. However, no contributions have yet been made from embryology and floral morphoanatomy. The main objective of this work was to contribute to the knowledge of the reproductive biology of Lessingianthus, Chrysloaena and Lepidaploa species, provide diagnostic characters to the taxonomy of the subtribe and improve the interpretation of phylogenetic relationships. For this reason, areas not yet analyzed or with fragmented information were studied, such as male fertility (meiotic configuration and behavior, spore production), pollen viability, male and female gametophyte development, floral and nectary morphoanatomy. Chromosome number analysis confirmed the basic numbers of the genera Lessingianthus (n=16), Chrysolaena (n=10) and Lepidaploa (n=14). New locality counts were reported from Chaco and Formosa populations of Ls. rubricaulis, and populations of C. cognata, C. flexuosa and C. lithospermifolia from Corrientes and Formosa. Regarding the ploidy level, diploids were identified and most of the entities were polyploids with different and high ploidy levels: in Lessingianthus diploid (2n=2x=32), tetraploid (2n=4x=64), hexaploid (2n=6x=96), octoploid (2n=8x=128) and decaploid (2n=10x=160) cytotypes were reported; in Chrysolaena diploid (2n=2x=20), tetraploid (2n=4x=40) and hexaploid (2n=6x=60) cytotypes were reported. The study of meiotic configurations revealed five different types of configurations including univalent (I), bivalent (II) and tetravalent (IV) formation. The abundance of bivalent configurations in comparison to the low proportion of multivalents observed, indicates that chromosomal rearrangements have occurred in the taxa analyzed tending to stabilize their meiosis process, therefore they possess high meiotic stability; in the particular case of L. plantaginoides (4x), we were able to infer its autotetraploid nature and confirm that it is a highly diploidized entity. The analysis of male fertility allowed us to determine that both diploid and polyploid species showed regular meiotic behavior higher than 70%, a high percentage of tetrad formation and high percentages of viable pollen. Meiosis I proved to be the most unstable phase, especially anaphase I, which presented the greatest variability of meiotic aberrations, and the main mechanisms of non-reduced gamete formation were: chromosomes out of plate, bridges without fragment, asynchrony in meiosis I and II. The results allowed us to rule out the hypothesis that polyploid entities would have high meiotic instability and therefore low fertility. We inferred that the analyzed entities are paleopolyploid taxa and confirmed that the genomes of the analyzed species underwent chromosomal rearrangements that restored their fertility. The results of the study of male and female gametophyte development are novel for the subtribe, contribute to the knowledge of the reproductive biology of the species, and can be used for taxonomic and evolutionary purposes. The development of the male gametophyte and anther wall does not vary considerably among the different genera or species; the following characters of the androecium are conserved and common to the analyzed species of the three genera: tetrasporangiate anthers, anther wall consisting of four layers (endothecium, middle layer, epidermis and mat) of dicotyledon-like development, persistent epidermis and invasive non-syncytial tapetum, tetrads of tetragonal and tetrahedral arrangement, and pollen grains released in tricellular stage. Other features such as the arrangement of the primary sporogenous cells in a vertical row within the anther and the development of the tapetum, require further and exhaustive study among the other genera of the tribe. The development of the female gametophyte exhibits uniform characters (such as the formation of a linear tetrad of megaspores, the presence of monosporic embryo sacs, functional chalazal megaspore and Polygonum-like development) and variable characters (thickness and onset of differentiation of the integumentary mat, the behavior of the antipodes and synergids) that may be of taxonomic utility. Mature asexual embryo sacs were observed in low proportion in two diploid species belonging to the genera Lessingianthus and Lepidaploa. Despite this, all species (diploid and polyploid) studied in this work formed sexual reduced gametophytes and therefore we infer that they reproduce sexually. This study constitutes the first contribution to the embryology of the South American genera of the tribe Vernonieae, and at the same time, it is the first analysis of the ploidy level in relation to mode of reproduction. The analyzed characters of the floral morphoanatomy presented different degrees of variation and taxonomic relevance; there are useful characters at specific level that collaborate in the identification of morphologically similar species (shape of the apical appendix of the anther and presence of glandular trichomes in the style and anthers); characters with intrapopulational variability of doubtful taxonomic utility (number of ribs of the ovary, shape of the calcium oxalate crystals, basal stylar nodule, idioblasts of the wall of the anther, idioblasts of the ovary wall and glandular trichomes of the ovary); and new, understudied variable characters that may be taxonomically useful (presence/absence of corolla mesophyll canals, shape of the outer and inner corolla epidermis, thickness of the corolla cuticle and composition of the ovary wall). These characters provide new perspectives of analysis for the species of the tribe Vernonieae, and therefore they can be of great taxonomic utility between genera circumscription. Moreover, the statistical analysis performed was useful to separate the species of the genera Lessingianthus and Chrysolaena, while the species of the genus Lepidaploa presented intermediate characters between the genera Chrysolaena and Lepidaploa. Although the three genera share morphological and anatomical similarity, the present chapter provides new perspectives of analysis, and therefore new opportunities in the search for synapomorphies that support the division of the genera under study. The study of the morphoanatomy of the nectaries is the first one carried out in the species of the genera studied. All the species studied presented a "gynoecialia" type of nectary located in the upper portion of the ovary and attached to the lower portion of the style, of annular shape with scattered nectarostomes. The nectaries are conserved with respect to anatomy (such as features of epidermal tissue, underlying secretory parenchyma and vascular tissue), topographical location and general morphology. Certain morphological characters varied in terms of size (height and width) and shape of the upper edge of the nectary, type, density and distribution of nectarostomes, stomatal width and pubescence. The observed diversity allowed us to classify the nectaries into four different morphotypes: Type I, Type II, Subtype IIa and Type III. This classification is supported by statistical analysis based on qualitative and quantitative characters. The variable characters are useful from a taxonomic point of view to discriminate between morphologically similar species and can be useful to understand the relationships between the genera of the tribe Vernonieae, without neglecting other important characteristics such as reproductive biology and the ecological context in which the nectaries develop. Through the results obtained, we contributed to the knowledge of the reproductive biology of species of the genera Lessingianthus, Chrysolaena and Lepidaploa. Through cytogenetic studies we inferred the nature of the species (auto or allotetraploid), the age of the polyploids (neo or paleopolyploid), male fertility and clarified the cytological mechanisms involved in the formation of unreduced gametes. Embryological studies have introduced new taxonomically useful characters and have clarified the mode of reproduction of polyploids. The analysis of floral morphoanatomy and nectary diversity has provided a valuable source of useful data that contribute to the circumscription of the three genera and raise new perspectives of study in the Tribe Vernonieae. Given that the fertility of the studied species is high, (both diploids and polyploids have high percentages of meiotic regularity), they produced normal tetrads and viable pollen grains, while forming embryo sacs of sexual origin, we reject the initial hypothesis that polyploids would have high percentages of meiotic irregularity, low fertility, and would form mainly asexual sacs of apomictic nature. Finally, based on the above mentioned, we confirm that the species with high ploidy levels are highly diploidized and sexually reproducing polyploids.