Evaluación del poder neutralizante de suero anti fosfodiesterasa (PDE) crotálica

Abstract

Los accidentes ofídicos representan un importante problema de salud pública en las zonas tropicales y subtropicales del mundo. Cada año, más de 2,5 millones de personas son mordidas por serpientes venenosas resultando en alrededor de 120.000 muertes. El nordeste argentino es un área geográfica destacada por la presencia de serpientes, dado el clima subtropical que la caracteriza, y por ende de accidentes ofídicos, afectando principalmente a poblaciones marginales y de bajos recursos. El veneno de Crotalus durissus terrificus (C. d. terrificus), serpiente conocida como cascabel sudamericana, posee actividades neurotóxicas, miotóxicas y produce un edema discreto. Son diversas las sustancias tóxicas que componen este veneno: fosfolipasas del tipo A2 (PLA2s) (componentes mayoritarios), serinoproteinasas con actividad thrombin-like (TLE), ecto-5′- nucleotidasas, metaloproteinasas, glutaminil ciclasas y fosfodiesterasas (PDEs); encontrándose estas últimas en muy baja concentración en el veneno (menos del 2%). La mayoría de los trabajos realizados están centrados en el estudio del efecto neurotóxico o miotóxico, ya sea del veneno entero, o de los componentes responsables de causar estas alteraciones, crotoxina (CTX) o PLA2, respectivamente. Menos atención, sin embargo, ha recibido las restantes propiedades farmacológicas de sus componentes y en particular, las producidas por las PDEs. A partir de los antecedentes sobre el tema y el interés en abordar un mejor conocimiento de estas enzimas, se propuso la obtención de anticuerpos contra una enzima PDE purificada del veneno de C. d. terrificus y la evaluación de su capacidad neutralizante. Asimismo, utilizar los anticuerpos anti CDT-PDE como herramienta para detectar la presencia de PDEs en venenos botrópicos de importancia sanitaria en el nordeste argentino. Para llevar a cabo esta propuesta, se purificó la enzima PDE del veneno por dos pasos cromatográficos: exclusión molecular (Sephadex G-75) seguida de intercambio iónico (Q-FF, FPLC) y se la nombró CDT-PDE. Se recolectaron las fracciones de interés, se caracterizaron y se usaron como antígenos. Grupos de 5 ratones (BALB/c) se inmunizaron por vía subcutánea los días 0, 15 y 30 con CDT-PDE emulsionada con adyuvante de Freund (completo e incompleto, posteriormente). Las dosis seleccionadas fueron dosis crecientes: 0.3, 0.6 y 1.2 g respectivamente. Un grupo control de 4 ratones, fue inmunizado reemplazando la proteína ofídica por tampón de fosfatos salino (PBS). Se recogieron muestras de sangre sin anticoagulante de la punta de la cola de los animales los días 14, 29, 41 y 50, al finalizar el plan de inmunización. El suero obtenido fue destinado a realizar ensayos de ELISA con el fin de evaluar la respuesta inmune de los animales, obteniéndose un título de 1/1600. A partir del suero se purificaron los anticuerpos por cromatografía de afinidad (Hi Trap Protein G HP), nombrados anti CDT-PDE. Se realizaron pruebas de neutralización para evaluar la capacidad bloqueante de los anticuerpos de la actividad PDE de la enzima pura (159 μg), observándose neutralización parcial de la misma (58 %). Adicionalmente, se utilizó el ensayo de Dot-Blot para evaluar la reactividad cruzada del suero anti CDT-PDE con dos venenos botrópicos de importancia sanitaria en la región nordeste de Argentina (Bothrops alternatus y Bothrops diporus). Los resultados mostraron una reacción cruzada indicando un grado de similitud estructural entre las PDEs de los venenos crotálicos y botrópicos.