Análisis de la variabilidad cromosómica en el grupo de liolaemus boulengeri (iguania : liolaemidae) del género liolaemus de Argentina

Abstract

Liolaemus es el género de lagartos más representativo de Sudamérica, y con 283 especies, es uno de los géneros de vertebrados más diverso del planeta. Este género presenta una de las mayores diversidades de formas y adaptaciones ecológicas, exhibiendo numerosas especializaciones morfo-anatómicas, fisiológicas, etológicas y reproductivas, por lo que es un grupo de interés para diversas especialidades de la biología. Los estudios citogenéticos en el género han tenido un aumento moderado hasta finales de los años 90. Sin embargo, desde la última revisión en el año 2005, solo se han realizado análisis citogenéticos en media docena de especies de Liolaemus, mientras que el género en el mismo periodo aumentó en cerca de 100 taxones. Además, parte de las descripciones cariotípicas disponibles no brindan información sobre el material de referencia, localidad de muestreo e institución donde fue depositado el mismo. Esta imposibilidad de revisar los ejemplares analizados, sumado a los numerosos cambios taxonómicos realizados en Liolaemus, ha llevado a que la asociación cariotipo-especie sea muy imprecisa en la mayoría de los casos. Asimismo, recientemente se ha reconocido la existencia de una especie triploide y partenogenética que es única dentro de los iguánidos pleurodóntidos. Finalmente, los estudios filogenéticos basados en secuencias mitocondriales convencionales no han sido útiles para resolver muchos de los clados a nivel específico, por lo que se requiere de regiones que presenten mayor variabilidad para optimizar los análisis filogenéticos en los clados de reciente radiación, como el clado de L. wiegmanii. Por lo expuesto, en esta Tesis se plantea como objetivo general realizar estudios de citogenética comparada en el grupo de Liolaemus boulengeri para inferir los mecanismos y tendencias de cambios cromosómicos y caracterizar los mitogenomas de algunas especies para identificar regiones de alta variabilidad nucleotídica o estructural. Para alcanzar dicho objetivo se realizaron extensas campañas de colección abarcando la mayor parte del área de distribución del género en Argentina. Como resultado se han identificado tres nuevas especies y clarificado la posición taxonómica de algunas de ellas. Asimismo, se ha contribuido a delimitar la distribución geográfica de algunos de los taxones estudiados en esta tesis. Desde el punto de vista citogenético se ha hecho una extensa revisión a fin de asignar los números cromosómicos publicados a las especies aceptadas actualmente, mediante la localización de materiales testigos y su correcta identificación taxonómica. De esta revisión, del total de 118 registros publicados, se han podido asignar los números cromosómicos a 61 especies reconocidas en la actualidad y debidamente documentadas. Como resultado de los estudios citogeneticos realizados en esta tesis se determinaron los números cromosómicos en 72 ejemplares, cubriendo la mayor parte del área de distribución del género en Argentina. La gran mayoría de los materiales presentaron un 2n=34 con un cariotipo compuesto por 12 macrocromosomas metacéntricos y 22 microcromosomas, con variaciones menores en el número de microcromosomas y la ultraestructura cromosómica. Los estudios meióticos permitieron estimar la frecuencia de recombinación en los cromosomas mayores y determinar, precisamente, el número de microcromosomas. En particular, la caracterización citogenética de la mayor parte de las especies de los clados de L. wiegmannii y L. darwinii en mitosis y meiosis, evidenció una gran estabilidad en morfología y número de cromosomas. Esta marcada estabilidad estructural se evidenció en la distribución de la heterocromatina y la localización de las regiones organizadoras de los nucléolos. En conjunto, los datos cromosómicos reflejan que, a pesar de ser grupos muy especiogénicos, presentan un alto grado de conservación cariotípica. Los análisis citogenéticos realizados y los preexistentes evidenciaron que L. parthenos es la única especie en la que se han citado individuos triploides en el subgénero Eulaemus. Asimismo, los análisis realizados en poblaciones de toda el área de distribución de esta especie permitieron confirmar que es la única especie exclusivamente triploide y partenogenética del género. Las evidencias cromosómicas y moleculares (ADNm), sustentan que L. darwinii habría intervenido en la línea matrilineal que dio origen a L. parthenos. Bajo una hipótesis de origen híbrido de L. parthenos, los datos de esta tesis no permitieron dilucidar a la/ las otras especies parentales. La condición de heterocariotipo para una fisión céntrica en el cromosoma #3 sugiere que la otra especie que le dio origen no pertenecería al clado de L. darwinii, o que sí lo fuera, estaría extinta o aún no estudiada. Alternativamente, los cambios cromosómicos (fisión céntrica y reducción del número de los microcromosomas) deberían haber ocurrido postpoliploidización, fijándose antes de la expansión del triploide. Bajo una hipótesis alternativa de origen autotriploide a partir de una población diploide de L. darwinii con algún grado de partenogénesis, tanto la fisión céntrica en un complemento como la reducción a 10 microcromosomas en los tres juegos de cromosomas se habrían producido postpoliploidizacion y fijado antes de la dispersión del triploide. Finalmente, se han ensamblado de novo los mitogenomas de tres especies a partir de secuencias obtenidas por Next Generation Sequencing. El análisis comparativo mostró una alta conservación de la estructura general de los mismos. Sin embargo, se identificaron dos regiones hipervariables de repeticiones en tandem en la CR que explican, en gran parte, las variaciones en la longitud de los genomas. Se propone que los análisis de estas secuencias podrían ser de utilidad el estudio de las relaciones filogenéticas en muchos grupos de Liolaemus que han sido muy poco resueltos en las filogenias hasta ahora publicadas, así como para estudios poblacionales y filogeográficos en el género Liolaemus y en otros de la familia Liolaemidae.

Liolaemus is the most representative genus of lizards in South America, and with 283 species, it is one of the most diverse vertebrate genera on the planet. This genus presents one of the greatest diversity of forms and ecological adaptations, exhibiting numerous morpho-anatomical, physiological, ethological and reproductive specializations, making it a group of interest for various specialties in biology. Cytogenetic studies in the genus have had a moderate increase until the late 1990s. However, since the last revision in 2005, cytogenetic analyses have only been performed on half a dozen species in Liolaemus, while the genus in the same period increased by about 100 taxa. In addition, some of the available karyotypic descriptions do not provide information on the reference vouchers, sampling locality and institution where it was deposited. This impossibility of revising the control specimens analyzed, added to the numerous taxonomic changes made in Liolaemus, has led to the karyotype-species association being very imprecise in many cases. Also, the existence of a triploid and parthenogenetic species that is unique within the pleurodontid iguanids has recently been recognized. Finally, phylogenetic studies based on conventional mitochondrial sequences have not been useful to resolve many of the clades at a specific level, so that regions with greater variability are required to optimize phylogenetic analyses in recently radiating clades, such as the L. wiegmannii group. Therefore, the general objective of this thesis is to perform comparative cytogenetic studies in the group of Liolaemus boulengeri to infer the mechanisms and trends of chromosomal changes and to characterize the mitogenomes of some species to identify regions with high nucleotide or structural variability. To achieve this objective, extensive collection expeditions were carried out covering most of the distribution area of the genus in Argentina. As a result, three new species have been identified and the taxonomic position of some of them has been clarified. Likewise, we have contributed to delimit the geographic distribution of some of the taxa studied in this thesis. From the cytogenetic point of view, an extensive revision has been done in order to assign the published chromosome numbers to the currently accepted species, through the localization of vouchers and assigning their correct taxonomic identification. From this review, of the 118 published records, chromosome numbers were undoubtedly assignet to 61 currently recognized and properly documented species. As a result of the cytogenetic studies done in this thesis, chromosome numbers have been determined in 72 specimens, covering most of the distribution area of the genus in Argentina. The great majority of the materials presented a 2n=34 with a karyotype composed of 12 metacentric macrochromosomes and 22 microchromosomes, with minor variations in the number of microchromosomes and chromosome ultrastructure. Meiotic studies allowed estimating the frequency of recombination in the macrochromosomes and precisely determining the number of microchromosomes. In particular, cytogenetic characterization of most species of the L. wiegmannii and L. darwinii groups in mitosis and meiosis evidenced a high stability in morphology and chromosome number. This marked structural stability was evidenced by the distribution of heterochromatin and the location of nucleolus-organizing regions. Overall, the chromosomal data reflect that despite being highly speciogenic groups, they show a high degree of karyotype conservation. The cytogenetic analyses carried out and the pre-existing ones evidenced that L. parthenos is the only species in which triploid individuals have been cited in the subgenus Eulaemus. Likewise, the analyses carried out in populations throughout the distribution area of this species confirmed that it is the only exclusively triploid and parthenogenetic of the genus. Chromosomal and molecular (mDNA) evidence supports that L. darwinii would have been involved in the matrilineal line that gave rise to L. parthenos. Under a hypothesis of hybrid origin of L. parthenos, the data of this thesis did not allow elucidating the other parental species. The heterokaryotype condition for a centric fission on chromosome #3 suggests that the other parent species would not belong to the L. darwinii group, or if it did, it would be extinct or not yet studied. Alternatively, the chromosomal changes (centric fission and reduction in the number of microchromosomes) should have occurred postpolyploidization, becoming fixed before the expansion of the triploid. Under an alternative hypothesis of autotriploid origin from a diploid population of L. darwinii with some degree of parthenogenesis, both the centric fission in one complement and reduction to 10 microchromosomes in all three chromosome sets would have occurred postpolyploidization and fixed prior to triploid dispersal. Finally, the mitogenomes of three species were assembled de novo from sequences obtained by NGS. Comparative analysis showed a high conservation of their overall structure. However, two hypervariable regions of tandem repeats were identified in the RC that largely explain the variations in genome length. It is proposed that analyses of these sequences could be useful for the study of phylogenetic relationships in many groups of Liolaemus that have been poorly resolved in the phylogenies so far published as well as for population and phylogeographic studies in the genus Liolaemus and others in the family Liolaemidae.