Desarrollo de un protocolo para la amplificación por PCR de microsatélites en yerba mate

Abstract

La Yerba Mate (Ilex paraguariensis) es una planta importante en América del Sur debido a su valor económico y cultural. A pesar de ello aún son incipientes los estudios de biodiversidad que se ocupan de esta especie. Los marcadores moleculares son herramientas poderosas para analizar la diversidad del genoma. Los microsatélites siguen siendo el marcador de elección para estudios de diversidad y estructura genética, en los que la codominancia es esencial. Se trabajó en el desarrollo de microsatélites como marcadores moleculares para su uso en estudios de diversidad en yerba mate. Las secuencias del genoma de I. paraguariensis se descargaron del repositorio “Assembly” del NCBI (National Center for Biotechnology Information de los EE. UU.). Luego, por medio del programa KRAIT v1.3.3 se realizó la búsqueda, análisis y clasificación de secuencias compatibles con las características de los microsatélites. Según la definición de microsatélite perfecto (SSR: Simple Sequence Repeats), las repeticiones mínimas deben ser 12 para mononucleótidos, 7 para dinucleótidos, 5 para trinucleótidos, 4 para tetranucleótidos, 4 para pentanucleótidos y 4 para hexanucleótidos. En los microsatélites imperfectos (iSSR: imperfect SSR), además se admiten sustituciones e indels. Así se identificaron 353.088 SSRs y 1.704.005 iSSRs. Entre los SSRs, los motivos repetitivos más abundantes en el genoma fueron: el mononucleótido A (40,54%), los dinucleótidos AG (19,30%), AT (12,47%), AC (8,32%), el mononucléotido C (3,72%), los trinucleótidos ACC (3,14%), AAG (2,27%), AAT (2,22%), AAC (0,55%) y el tetranucleótido AAAT (1,59%). A partir de estos resultados, se seleccionaron 50 SSRs, y sobre sus regiones adyacentes se diseñaron pares de cebadores específicos utilizando la herramienta PRIMER3 PLUS. A continuación, se realizó la extracción de ADN a partir de hojas con el kit GenEluteTM (SIGMA), se evaluó la integridad en gel de agarosa 0,8% y tinción con el colorante GelGreen® (Biotium®) y posteriormente el ADN genómico se cuantificó por absorción a 260 nm en un equipo NanoDrop (Thermo). Por último, se desarrolló un protocolo de PCR, que permite la amplificación de manera individual de 9 microsatélites perfectos. Estos marcadores específicos de Yerba Mate permitirán realizar estudios de polimorfismo genético y de diversidad en esta especie, lo que será de gran importancia para su conservación y para su uso en programas de mejoramiento genético. Además, la metodología utilizada en este trabajo podrá ser adaptada y aplicada en la búsqueda de microsatélites en otras especies cercanas de Ilex. La transferibilidad de microsatélites entre especies relacionadas está permitida por la naturaleza homóloga de la secuencia de ADN en las regiones flanqueantes de microsatélites.