Estudio de hidrogeles de palmitato de ascorbilo (ASC16) para el transporte y liberación de macromoléculas. Su aplicación con proteínas ofídicas

Abstract

Un suero antiofídico es un inmunobiológico formado por inmunoglobulinas o fragmentos de ellas con capacidad de neutralizar la toxicidad de proteínas ofídicas. Se produce inmunizando animales de gran porte (caballos) que son inoculados con dosis sucesivas y crecientes de veneno para posteriormente purificar y procesar los anticuerpos generados, obteniendo el suero antiofídico. Lo que se inocula en los animales para inmunizarlos es una formulación con tres componentes principales: Veneno, Matriz y Molécula adyuvante. Tradicionalmente se utilizó el adyuvante de Freund que consiste en una emulsión aceiteagua, como matriz, que puede tener micobacterias muertas (completo) o no (incompleto) como tercer componente. Dicho adyuvante es muy efectivo pero presenta diversos efectos adversos como abscesos no infecciosos en el sitio de la inoculación. Por esta razón se busca el diseño de nuevas nanoestructuras que puedan ser utilizadas como componente 2 y potencie la acción adyuvante del componente 3. Los hidrogeles de palmitato de ascorbilo (PA) son estructuras de auto-ensamble de dicha molécula y su potencial uso farmacológico viene siendo estudiado para su uso en el transporte y entrega de fármacos. En el presente plan de trabajo se propuso estudiar dicha nanoestructura como transporte y entrega de proteínas ofídicas. El estudio se enfocó en preparar hidrogeles en diferentes condiciones experimentales de temperatura (40°C y 50°C), concentración de PA (2,5 y 5 % p/v) y concentración de proteínas ofídicas (53, 530 y 5300 μg/mL). Además se realizaron ensayos para analizar si las actividades del veneno se modificaban por la interacción con la nanoestructura de PA, con diluciones de PA (0,4-0,05μM) y finalmente, si las formulaciones presentaban citotoxicidad. Se observó que las formulaciones preparadas a 40°C y una concentración de PA de 2,5% el gel era homogéneo de consistencia viscosa y al aumentar la temperatura (50° C) el gel se volvió firme. Al aumentar la concentración a 5% el gel era homogéneo y firme, independientemente de la temperatura empleada. Al incorporar veneno de Crotalus durissus terrificus en diferentes concentraciones a las formulaciones anteriores, la capacidad de gelificación no se modificó y los hidrogeles mantuvieron su consistencia. Por otro lado, las actividades del veneno pos-formulación del hidrogel se vieron afectadas. En la actividad hemolítica indirecta, las formulaciones redujeron un 50-65% de la actividad. Se evaluó el efecto neutralizante del PA sobre la actividad hemolítica indirecta y se realizaron ensayos de veneno pre-incubado con PA, dando como resultado que el veneno en presencia del PA reduce su actividad. La formulación se prepara con calentamiento a 40°C y 50°C y por ello analizamos la influencia de la temperatura en nuestras formulaciones realizando ensayos de actividad hemolítica indirecta y coagulación, indicando que las proteínas del veneno reducen su actividad un 7,7% y 8,2% luego de 12 minutos. 4 Con el fin de evaluar la citotoxicidad del PA, se trabajó sobre monocapas de células de cultivo in vitro, y se observó que al aumentar concentraciones de PA también aumentaban su toxicidad destruyendo a las células y formando espacios líticos. De esta manera se obtuvo información sobre una nueva preparación (matriz de PA + veneno) que pueda en un futuro ser utilizada como soporte en el diseño de nuevas vacunas de uso veterinario en la producción de suero antiofídico.