Caracterización de microorganismos contaminantes en sistemas de micropropagación de yerba mate (Ilex paraguariensis)

Abstract

Argentina is the world's largest yerba mate producer; the producing provinces are Misiones and Corrientes. This crop has several drawbacks such as low genetic and physiological seed quality, slow, even and low percentage germination and heterogeneity of plants grown from seed, which led to the necessity of developing micropropagation systems. One of the major difficulties in the yerba mate micropropagation is in vitro contamination by fungi and bacteria. Among the various factors that can influence the contamination of in vitro culture are the time of year, type of explant and the presence of surface and/or endophytic plant-associated microorganisms. Since endophytes live within plant tissues, they are able to survive surface disinfection making them harder to control. The aim of this work was to characterize the microorganisms contaminant of yerba mate micropropagation systems and establish their source. The composition and diversity of the endophytic community associated with aerial organs of yerba mate (Ilex paraguariensis) was investigated using culture-depending methods. Fungal and bacterial endophytes were isolated from young and adult leaves and branches of three yerba mate clones growing under field condition in Corrientes province, Argentina. Besides, in order to establish if most of the contaminants of yerba mate in vitro culture corresponded to endophytes from field or greenhouse growing plants, contaminant microorganisms were isolated from in vitro micropropagated, and greenhouse plants. Fungi were identified based on their micromorphological characteristics and internal transcribed spacer (ITS) rDNA sequence analysis; for bacteria 16S rDNA sequence analysis was used. A total of 156 fungal and 193 bacterial isolates were obtained. Bacteria predominated in stem samples while leaf samples retrieved similar amount of bacterial and fungal isolates. No significant differences were found in isolate quantity nor diversity among seasons or between young and older leaves and stems. The most frequently isolated fungus was Fusarium, followed by Colletotrichum; they were both present in all the sampling seasons and organ types assayed. Other 12 fungus genera were identified including Aspergillus, Cercospora, Clonostachys (Bionectria), Curvularia, Guignardia, Microsphaeropsis, Neofusicoccum, Nigrospora, Paecilomyces, Penicillium, Phomopsis (Diaporthe), and Phyllosticta. Actinobacteria represented 61% of all bacterial isolates. The most dominant bacterial taxa were Curtobacterium and Microbacterium. They were isolated from all the organs assayed, 4 showing that they are ubiquitous endophytes. Other bacteria frequently found throughout the year were Methylobacterium, Sphingomonas, Herbiconiux and Bacillus. The predominant fungi and bacteria detected in yerba mate were similar to those reported in other species in which the same type of technique was used. Fungal genera Curvularia, Fusarium, Penicillium, Setophoma, and bacteria Pantoea and Staphylococcus were isolated as contaminants of in vitro culture and as endophytes in plants grown under greenhouse and field conditions. Alternaria was t isolated as a contaminant of in vitro culture and as endophyte in plants grown in the field, as well as the bacteria Janibacter. Fusarium was the most numerous fungal genus. 8 Fusarium species were identified, and pathogenicity on yerba mate was assayed in three of them (F. oxysporum, F. pseudocircinatum y F. subglutinans), showing that they behave as endophytes when plants are grown under field conditions but are pathogenic to in vitro plants (vitropathogens). The results obtained in this thesis showed that most of the yerba mate in vitro culture contaminants are endophytic microorganisms that occur also in field or greenhouse grown plants without showing any negative effect on ex vitro plants. We have also determined that the number and diversity of fungal and bacterial isolates are affected by the season, being higher during fall and summer, as well as the organ type and age.

Argentina es el primer productor mundial de yerba mate, las provincias productoras son Misiones y Corrientes. Este cultivo presenta varios inconvenientes, como la baja calidad genética y fisiológica de las semillas, la lenta y desuniforme germinación con un bajo porcentaje y la heterogeneidad de las plantas obtenidas a partir de semillas, que llevaron a la micropropagación. Una de las mayores dificultades en la micropropagación de yerba mate es la contaminación in vitro por hongos y bacterias. Entre los diversos factores que pueden influir en la contaminación de cultivo in vitro están la época del año, el tipo de explante y la presencia de microorganismos superficiales y/o endófitos asociados a las plantas. Los microorganismos endofíticos fueron encontrados en todas las plantas estudiadas en diferentes órganos vegetales, si bien su relación con las plantas no son comprendidas en su totalidad, se encontraron que producen efectos benéficos sobre sus hospedantes, cumpliendo algún rol importante para la fisiología de la planta, sin embargo cuando éstos se encuentran en explantes cultivados in vitro son considerados contaminantes. Su control se hace dificultoso debido a que al habitar los tejidos vegetales internos sobreviven a la desinfección superficial. El objetivo de esta tesis fue caracterizar a los microorganismos contaminantes de sistemas de micropropagación de yerba mate (Ilex paraguariensis) con el fin de determinar su origen. Existen muy pocos antecedentes sobre microorganismos endofíticos en la yerba mate, para ello en este trabajo se realizaron muestreos de hojas y tallos de plantas crecidas en el campo en diferentes fechas. Además, para confirmar que los contaminantes del cultivo in vitro de yerba mate son en su mayoría endófitos de plantas crecidas en el campo y/o invernadero, se aislaron contaminantes en la micropropagación de yerba mate y se realizaron muestreos de hojas y tallos de plantas crecidas en invernadero. Para la identificación de microorganismos se usaron la técnica morfológica y molecular amplificando por PCR y secuenciando el ITS para hongos y 16S para bacterias. De los endófitos aislados de plantas crecidas en el campo se identificaron 14 géneros de hongos Aspergillus, Cercospora, Colletotrichum, Curvularia, Fusarium, Gliocladium (Bionectria), Guignardia (Phyllosticta), Microsphaeropsis, Neofusicoccum, Nigrospora, Paecilomyces, Penicillium, Phomopsis (Diaporthe) y Trichoderma, y 20 géneros de bacterias, Aeromicrobium, Bacillus, Brevundimonas, 2 Curtobacterium, Herbiconiux, Kineococcus, Leucobacter, Lysinibacillus, Methylobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Paenibacillus, Pantoea, Phenylobacterium, Rhizobium, Roseomonas, Sphingomonas, Staphylococcus y Xylophilus. Los géneros de hongos Curvularia, Fusarium, Penicillium, Setophoma, y de bacterias Pantoea, Staphylococcus fueron aislados como contaminantes de cultivo in vitro y como endófitos de plantas crecidas en invernadero y a campo. Alternaria fue el género de hongo que se aisló como contaminante de cultivo in vitro y como endófito de plantas crecidas a campo al igual que las bacterias Janibacter. También se determinó que el género de hongo que se encontró en mayor número fue Fusarium, se identificaron 8 especies y se probó la patogenicidad de 3 de ella en cultivo in vitro de yerba mate (F. oxysporum, F. pseudocircinatum y F. subglutinans) y se determinó que pueden ser endófitos en plantas crecidas en el campo y patógenos en el cultivo in vitro (vitropatógenos). Con los resultados de este trabajo se pudo confirmar que la mayoría de los contaminantes en cultivo in vitro son microorganismos endofíticos presentes en plantas crecidas a campo o en invernáculo que no afectan negativamente el crecimiento en condiciones ex vitro. Además, se determinó que el número de aislamientos y diversidad de hongos y bacterias están influenciados por la época de muestreo, presentándose los mayores valores en otoño y verano, además están influenciados por el tipo de órgano vegetal y su edad.